يقيس هذا البروتوكول مستويات البروتين دون الخلية في كل مكان والنشاط البروتيفي في دماغ القوارض مما يسمح في إطار الموضوعات بإجراء مقارنات حول كيفية تغير النشاط في كل مكان أو البروتيم استجابة للنشاط الخلوي أو التعلم أو المرض. يسمح البروتوكول بجمع الكسور المتشابكة والسيكتوبلازمية والنووية من نفس دماغ القوارض. والتقليل إلى أدنى حد من الخسارة، يمكن أن يتم ذلك بكميات صغيرة من الأنسجة ومعدات مختبرية أساسية.
إثبات الإجراء سيكون تايلور مكفادين، طالب دراسات عليا من مختبري. ابدأ هذا الإجراء مع جمع وتشريح أنسجة الدماغ القوارض كما هو موضح في بروتوكول النص. التأكد من أن نصف الكرة الأرضية المستخدم متوازن في ظروف الاستخراج لكل مجموعة تجريبية.
إزالة 1.5 ملليلتر الطرد المركزي الأنابيب الدقيقة التي تحتوي على نصف الكرة الأرضية واحد من المنطقة ذات الاهتمام من الفريزر ناقص 80 درجة مئوية. باستخدام مشرط، نقل أنسجة المخ المجمدة إلى اثنين ملليلتر الزجاج التفلون التجانس. إضافة 500 ميكرولترات من عازلة التحلل إلى أنبوب تفلون.
باستخدام الآفة B، التجانس نفس الأنسجة مع 15 السكتات الدماغية حتى لا يوجد كمية مرئية من المواد الصلبة موجودة. استخدم حركة الدوران أثناء كل ضربة. مع ماصة 1000 ميكرولتر، نقل العينة المتجانسة إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر microcentrifuge.
ضع الأنبوب على الثلج الرطب وحضن لمدة 30 دقيقة. وضع الأنبوب في microcentrifuge وتدور لمدة 10 دقائق في 845 مرات ز في أربع درجات مئوية. بعد الانتهاء، وإزالة بعناية عظمى عن طريق الأنابيب ووضعها في أنبوب جديد microcentrifuge 1.5 ملليلتر.
هذا هو الكسر السيتوبلازمي إضافة 50 ميكرولترات من استخراج العازلة إلى بيليه الناتجة و resuspend عن طريق الأنابيب. لا دوامة بيليه.
وضع أنبوب يحتوي على بيليه resuspended على الجليد واحتضان لمدة 30 دقيقة. ثم الطرد المركزي الأنبوب لمدة 20 دقيقة في 21، 456 مرات ز في أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، وإزالة بعناية سوبرانت عن طريق الأنابيب ووضع في أنبوب جديد 1.5 ملليلتر microcentruge.
هذا هو الكسر النووي التجانس نصف الكرة الأرضية واحد من المنطقة ذات الأهمية كما كان من قبل باستثناء استخدام 500 ميكرولترات من العازلة TEVP بدلا من العازلة تحلل. باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر، نقل عينة متجانسة إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر microcentrifuge.
الطرد المركزي العينة في 1،000 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. جمع سوبرنات ونقلها إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر microcentrifuge باستخدام 1، 000 ماصة ميكرولتر. جهاز طرد مركزي العينة في 10،000 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.
تخلص من الكريه الأصلي الذي يحتوي على النوى والحطام الكبير. نقل عظمى إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر microcentrifuge. هذا هو الكسر السيتوسوليك
إضافة 50 ميكرولترات من العازلة التجانس إلى بيليه و resuspend عن طريق الأنابيب حتى لا تكون المواد الصلبة مرئية. الطرد المركزي العينة في 20، 000 مرة ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. نقل عظمى إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر microcentrifuge.
هذا هو جزء الغشاء السيني بالزيتان الخام. لإعداد الفحص ، prewarm قارئ لوحة إلى 37 درجة مئوية وعقد من خلال المدى. تعيين الإثارة إلى 360 نانومتر والانبعاثات إلى 460 نانومتر.
إذا كان 96 لوحة جيدا المستخدمة واضحة، تعيين موقف البصريات إلى أسفل. إذا تم استخدام لوحة 96 جيدا الظلام، تعيين موقف البصريات إلى الأعلى. برنامج تشغيل الحركية مع وقت ساعتين المسح كل 30 دقيقة.
إعادة تشكيل 20S 10X المخزن المؤقت للمحسّن المتوفرة في المجموعة مع 13.5 ملليلتر من الماء فائقة الخطورة. إضافة 14 ميكرولترات من ATP 100 ملليمولار إلى المخزن المؤقت 1X الآن. وهذا يعزز بشكل كبير نشاط proteasome في العينات ويحسن موثوقية المقايسة.
إعادة تشكيل معيار AMC المقدمة في مجموعة مع 100 ميكرولترات من DMSO. تنفيذ الخطوات باستخدام معيار AMC في ظروف الإضاءة الداكنة أو في ظروف الإضاءة المنخفضة حيث أن المعيار حساس للضوء. إنشاء منحنى قياسي من AMC من سلسلة من تركيزات AMC عالية إلى منخفضة.
سيتم استخدام هذا المنحنى لمعايرة قارئ لوحة وتحليل النشاط proteasome في العينات المتجانسة. إعادة تشكيل الركيزة بروتية المقدمة في مجموعة مع 65 ميكرولترات من DMSO. أيضا تنفيذ هذه الخطوة في الظلام أو في ظروف الإضاءة الخافتة كما الركيزة هو الضوء الحساسة.
ثم إنشاء تخفيف واحد إلى 20 من الركيزة proteasome في أنبوب جديد 1.5 ملليلتر microcentuge باستخدام 20S العازلة المقايسة. إضافة كمية عادية من العينات المطلوبة إلى لوحة 96 جيدا. تشغيل كل عينة في مكررة.
كمية العينة اللازمة تختلف على أساس إعداد الأنسجة. عموما، 10 إلى 20 ميكروغرام كافية لأي كسر دون الخلية. جلب حجم العينة جيدا إلى 80 ميكرولترات مع المياه فائقة الpure.
يعتمد المبلغ المضاف على حجم العينة المضافة. في بئرين منفصلين، أضف 80 ميكرولترات من الماء وحده. هذه ستكون الفراغات المقايسة
إضافة 10 microliters من 20S المخزن المؤقت إلى كل جيدا بما في ذلك الفراغات المقايسة. استخدم مكرر أو ماص آلي لضمان حجم المقايسة المتسق عبر الآبار. أطفئ الأنوار أو أدخل غرفة مظلمة.
أضف جميع 100 ميكرولترات من معايير AMC المخففة إلى بئر جديد باستخدام بئر واحد لكل معيار. في الظلام، استخدم مكرر أو ماصة آلية لإضافة 10 ميكرولترات من الركيزة البروتية المخففة إلى الآبار التي تحتوي على عينات وفراغات مقايسة ولكن ليس معيار AMC. ضع اللوحة في قارئ اللوحة وابدأ تشغيل الحركة.
تنفيذ القياس الكمي للعلامات متعددة polyubiquitin في مختلف الكسور دون الخلوية التي تم جمعها من أنسجة الدماغ القوارض باستخدام مجموعة متنوعة من بروتوكولات النشاف الغربية القياسية في تركيبة مع الأجسام المضادة متعددة الاستخدامات الفريدة الخاصة بالروابط. بعض الصور ubiquitin لطخة الغربية سوف توفر أعمدة من عصابات متميزة في حين أن البعض الآخر ينتج نمط مثل تشويه مع خطوط قليلة أو معدومة واضحة. للحصول على تحديد كمي لللطخات الغربية المُصوَّرة، ارسم صندوقًا حول العمود الذي يمتد سلم المعايير الجزيئية بأكمله.
ضبط مربع إذا ubiquitin تلطيخ لا تمتد من خلال سلم كامل. وهذا أمر شائع بالنسبة للتعديلات 48 lysine ويختلف على نطاق واسع عبر المقصورات دون الخلوية. وأخيراً، اطرح الخلفية التي يتم حسابها على أنها متوسط الكثافة البصرية للخلفية المحيطة مباشرة بالعمود من جميع الجوانب.
يظهر هنا هو القياس الكمي للنشاط البروتيم في كسور مختلفة تم جمعها من اللوزة الجانبي من نفس الحيوان. خلال فحص النشاط البرفي ، زادت وحدات الفلورسنت النسبية المكتشفة من بداية إلى نهاية المقايسة في الكسر المتشابك ، والكسر السيتوبلازمي ، والكسر النووي. منع مثبطات البروتية beta-lac RFUs من التغير عبر الجلسة.
ولوحظت اختلافات دون خلوية في النشاط البروتيمي في اللوزة الجانبي لنفس الحيوان. وقد تم الكشف عن زيادة في النشاط النووي في الحيوانات المدربة نسبة إلى الضوابط التي تتوافق مع انخفاض في النشاط داخل الجزء متشابك. وظل نشاط البروتيلازم السيتوبلازمي عند خط الأساس.
تظهر هنا اختلافات دون الخلية في كل مكان البروتين الخاص بالروابط في اللوزة الجانبي من نفس الحيوان بعد التعلم. كانت هناك زيادة في الانتشار الكلي في الكسر النووي بعد التعلم الذي يرتبط بانخفاض في الكسر السيتوبلازمي. بعد التعلم، زادت الكسور في كل مكان خطية في الكسور النووية ولكن ليس الكسور السيتوبلازمية أو متشابك.
ومن المثير للاهتمام، ارتفع في كل مكان K63 في الجزء النووي بعد التعلم الذي يرتبط مع انخفاض في جزء متشابك. في حين أن K48 uniquitination زاد في الكسور النووية والسيكتوبلازمية بعد التعلم ولكن ليس في جزء متشابك. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه البروتوكولة لفهم التوزيع دون الخلوية وظيفة البروتينات الأخرى داخل نفس الحيوان.
