Этот протокол измеряет субклеточный уровень убиквитина белка и протеасомную активность в мозге грызунов, позволяя в субъектах сравнивать изменения активности убиквитина-протеасомы в ответ на клеточную активность, обучение или болезнь. Протокол позволяет сбор синаптических, цитоплазмических и ядерных фракций из одного и того же мозга грызунов. Минимизируя потери, он может быть выполнен с небольшим количеством тканей и основным лабораторным оборудованием.
Демонстрацией процедуры будет Тейлор Макфадден, аспирант моей лаборатории. Начните эту процедуру со сбора и вскрытия ткани мозга грызунов, как описано в текстовом протоколе. Убедитесь, что используемое полушарие сбалансировано по условиям извлечения для каждой экспериментальной группы.
Удалите 1,5 миллилитровую центрифугу микротрубки, содержащую одно полушарие области интереса, из морозильной камеры минус 80 градусов по Цельсию. Используя скальпель, перенесите замороженную ткань мозга на двухми миллилитровый стеклянный тефлоновый гомогенизатор. Добавьте 500 микролитров буфера лиза в тефлоновую трубку.
Используя пестик B, гомогенизировать ту же ткань с 15 ударов, пока не видимое количество твердого материала присутствует. Используйте поворот движения во время каждого удара. С помощью трубы с 1000 микролитров перенесите гомогенизированный образец в новую микроцентрифугную трубку диаметром 1,5 миллилитра.
Поместите трубку на мокрый лед и инкубировать в течение 30 минут. Поместите трубку в микроцентрифуг и вращайся в течение 10 минут при 845 раз g при четырех градусах Цельсия. После завершения, тщательно удалить супернатант путем трубопроводов и поместить в новую 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку.
Это цитоплазмическая фракция. Добавьте 50 микролитров буфера извлечения в полученную гранулу и повторное добавление путем трубопроводов. Не вихрь гранулы.
Поместите трубку, содержащую перерасход гранулы на льду и инкубировать в течение 30 минут. Затем центрифуга трубки в течение 20 минут при 21, 456 раз г в четыре градуса по Цельсию. После центрифугации, тщательно удалите супернатант путем пипетки и поместите в новую 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку.
Это ядерная фракция. Гомогенизировать одно полушарие области интересов, как и прежде, за исключением использования 500 микролитров буфера TEVP вместо буфера лиза. Используя трубу из 1000 микролитров, перенесите гомогенизированный образец в новую микроцентрифугную трубку диаметром 1,5 миллилитра.
Центрифуга образца при 1000 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Соберите супернатант и перенесите его в новую микроцентрифугную трубку диаметром 1,5 миллилитра с помощью трубы с 1000 микролитров. Центрифуга образца при 10 000 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.
Откажитесь от оригинальной гранулы, которая содержит ядра и большой мусор. Перенесите супернатант в новую микроцентрифугную трубку с 1,5 миллилитром. Это цитозолическая фракция.
Добавьте 50 микролитров буфера гомогенизации в гранулы и повторно сметайте трубы до тех пор, пока не будет виден твердый материал. Центрифуга образца при 20 000 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите супернатант в новую микроцентрифугную трубку с 1,5 миллилитром.
Это сырая синаптосомная мембранная фракция. Чтобы настроить анализ, довоенной плиты читателя до 37 градусов по Цельсию и провести через перспективе. Установите возбуждение до 360 нанометров и выброс до 460 нанометров.
Если используемая пластина 96 хорошо ясна, установите положение оптики на дно. Если используется темная пластина 96 хорошо, установите положение оптики к началу. Программа кинетического запуска со временем два часа сканирования каждые 30 минут.
Восстановить 20S 10X анализ буфера, представленного в комплекте с 13,5 миллилитров ультрачистой воды. Добавьте 14 микролитров 100 миллимолярной АТФ в буфер 1X. Это значительно повышает протеасомную активность в образцах и повышает надежность анализа.
Восстановить стандарт AMC, предусмотренный в комплекте со 100 микролитров DMSO. Выполняйте шаги с использованием стандарта AMC в темных или условиях низкой освещенности, так как стандарт светочувствительный. Создайте стандартную кривую AMC от серии высоких до низких концентраций AMC.
Эта кривая будет использоваться для калибровки считывания пластин и анализа протеасомной активности в гомогенизированных образцах. Восстановить протеасомную субтаррату, предусмотренную в комплекте с 65 микролитерами ДМСО. Также выполните этот шаг в темноте или при условиях низкой освещенности, так как субстрат светочувствительный.
Затем создайте от одного до 20 разбавления протеасомного субстрата в новой микроцентрифуге 1,5 миллилитров с помощью буфера анализа 20S. Добавьте нормализованное количество желаемых образцов к пластине 96 хорошо. Вы запустите каждый образец в дубликате.
Количество необходимых образцов варьируется в зависимости от подготовки тканей. Как правило, от 10 до 20 микрограммов достаточно для любой субклеточной фракции. Довнесите объем образца до 80 микролитров с ультрачистой водой.
Добавленная сумма зависит от объема добавленной выборки. В двух отдельных скважинах добавьте только 80 микролитров воды. Это будут заготовки анализа.
Добавьте 10 микролитров буфера анализа 20S к каждому хорошо, включая заготовки анализа. Используйте ретранслятор или автоматизированную пипетку, чтобы обеспечить согласованный объем анализа скважин. Выключите свет или войдите в темную комнату.
Добавьте все 100 микролитров разбавленных стандартов AMC в новую колодец, используя один колодец для каждого стандарта. В темноте используйте ретранслятор или автоматизированную пипетку, чтобы добавить 10 микролитров разбавленного протеасомного субстрата в скважины, содержащие образец и заготовки анализа, но не стандарт AMC. Поместите пластину в считыватель пластин и начните кинетический пробег.
Выполните количественную оценку различных полиубикитиновых тегов в различных субклеточных фракциях, собранных из тканей мозга грызунов, используя различные стандартные западные протоколы блоттинга в сочетании с уникальными специфическими полиубикитин-антителами. Некоторые убиквитин западные помарки изображения обеспечат колонки различных полос пока другие производят мазок-как картина с немногими или никакими ясными линиями. Для количественной оценки изображения убиквитина западные помарки нарисуйте коробку вокруг колонны, которая простирается по всей лестнице молекулярных стандартов.
Отрегулируйте коробку, если окрашивание убиквитина простирается по всей лестнице. Это часто используется для модификаций лизина 48 и широко варьируется в разных подклеточных отсеках. Наконец, вычесть фон, который рассчитывается как средняя оптическая плотность фона непосредственно вокруг столбца со всех сторон.
Здесь показана количественная оценка протеасомной активности в различных фракциях, собранных из боковой миндалины одного и того же животного. В ходе анализа протеасомной активности in vitro относительные флуоресцентные единицы, обнаруженные, увеличивались от начала до конца анализа в синаптической фракции, цитоплазмической фракции и ядерной фракции. Ингибитор протеасомы бета-лак не позволял RFUs изменяться в течение всего сеанса.
Подклеточные различия наблюдались в протеасомной активности в боковой миндалинах одного и того же животного. Увеличение активности ядерной протеасомы было обнаружено у обученных животных по отношению к контролю, что соответствовало снижению активности внутри синаптической фракции. Цитоплазмическая протеасомная активность оставалась на базовом уровне.
Здесь показаны субклеточные различия в увязке специфического белка убиквитина в боковой миндалинах того же животного после обучения. После обучения произошло увеличение общей убиквитины в ядерной фракции, что коррелировало со снижением цитоплазмической фракции. После обучения, линейное убиквитинирование увеличилось в ядерной фракции, но не цитоплазмы или синаптические фракции.
Интересно, что K63 убиквитина увеличилась в ядерной фракции после обучения, которое коррелирует с уменьшением синаптической фракции. В то время как одноквититация K48 увеличилась в ядерных и цитоплазмических фракциях после обучения, но не в синаптической фракции. Этот протокол также может быть использован для понимания субклеточного распределения и функции других белков в том же животном.
