هذا البروتوكول مهم لأنه يمكن استخدامه لاستجواب ذخيرة المناعة من المتبرعين البشريين لتحديد نادرة، المضادة محددة الخلايا B. هذه التقنية تسمح لنا بالحصول على سلاسل ثقيلة وخفيفة مقترنة أصلاً، والتي يمكن استنساخها بسرعة، ثم اختبارها مباشرة ضد المستضد أو المستضدات ذات الأهمية. (سيثبت الإجراء سيكون (مايك مورتون ، فني من مختبرنا
بعد ساعة واحدة على الأقل من الذوبان والاسترداد، وجمع PBMC المانحة عن طريق الطرد المركزي. وإعادة تعليق الخلايا في 50 ملليلتر من الجليد الباردة MES العازلة للعد. بيليه الخلايا عن طريق طرد مركز آخر، وعزل CD22-إيجابية B-الخلايا عن طريق اختيار إيجابي مع الميكروبات CD22 وفقا للبروتوكولات القياسية.
جمع الخرزة معزولة CD22-إيجابية الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا في أربع مرات 10 إلى الخلايا السابعة لكل ملليلتر من تركيز Vax العازلة. إضافة IgG CD19 CD27 كوكتيل الأجسام المضادة إلى الخلايا وفقا لتوصيات الشركة المصنعة التخفيف مع خلط لطيف, و aliquot 10 إلى الخلايا السابعة في أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر للسيطرة السلبية. إضافة رباعيات البيوتين المسمى المزدوج steptavidin إلى أنبوب التحكم السلبي في تركيز نهائي من 36 نانومولار كل مع PE و APC، مضروبة في عدد الببتيدات في أنبوب الفرز.
جلب حجم النهائي في كل أنبوب 2.5 ملليلتر مع عازلة فاكس الطازجة وإضافة رباعيات الببتيد إلى نوع أنبوب في 36 نانوموللار كل PE و APC. بعد الطرد المركزي، وجلب الخلايا إلى مرتين 10 إلى 6 لكل 100 ميكرولترات من تركيز TBS لاحتضان 30 إلى 60 دقيقة، في الظلام، عند أربع درجات مئوية، مع التناوب. في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا مرتين في العازلة TBS الطازجة في غسل قبل إجهاد العينات في أنابيب تصفية قبعة المليلتر خمسة ملليلتر الفردية.
وصمة العينات مع تركيز 0.3 ميكروموللار النهائي من DAPI كعلامة على سلامة غشاء الخلية. وتشغيل السيطرة السلبية بأكملها على فارز الخلية لتعيين بوابات تدفق cytometry لعزل مجموعات الخلايا المناسبة لفرز خلية واحدة. رسم مستضد PE مقابل مستضد APC وتعيين بوابة R8 باعتبارها مستضد PE إيجابية، ورباع APC إيجابية مع عدد منخفض من الأحداث في بوابة إيجابية مزدوجة.
ثم، وفرز واحد CD19 إيجابية CD27-إيجابية مستضد PE إيجابية، مستضد APC إيجابية الخلايا في آبار الفردية من ماجستير ميكس أعدت 96 لوحة جيدا. في نهاية هذا النوع، تغطية لوحة مع منصات الشريط الألومنيوم، والطرد المركزي الخلايا لمدة دقيقة واحدة في 400 مرات ز قبل ناقص تخزين 80 درجة. لتنفيذ رد فعل النسخ العكسي، اذيب الخلايا B-الخلايا المفرزة على الجليد لمدة دقيقتين قبل أن يدور اللوح لمدة دقيقتين في 3300 مرة لسحب محتويات البئر إلى أسفل اللوحة قبل الفتح.
بعد علاج الخلايا مع مزيج ماجستير انزيم المناسبة، إضافة 2.5 ميكرولترات من الحمض النووي مجانية كقالب لكل تفاعل PCR، وإضافة التمهيديات إلى تركيز نهائي من 1 ميكرومولار لكل رد فعل. ثم، إضافة تركيز 2X من 10X البوليميراز العازلة إلى كل بئر لتحقيق حجم النهائي إلى 25 ميكرولترات لكل رد فعل. وتشغيل سلسلة الثقيلة والخفيفة تفاعل PCR كل لمدة 50 دورة.
في نهاية ردود الفعل، تشغيل العينات على 1٪ agarose هلام لتصور يضرب التضخيم إيجابية. عزل كل من التفاعلات المتسلسلة الثقيلة والخفيفة من نفس الخلية عن طريق استخراج الجل. تحديد تركيز جزء الحمض النووي بالكثافة البصرية إلى 60 للعمليات الحسابية الدقيقة لمزيج الربط.
الجمع بين شظايا سلسلة الثقيلة والخفيفة المستردة مع جزء رابط والعمود الفقري ناقلات التعبير باستخدام تفاعل ربط التجزئة الأربعة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. وتحويل التفاعلات ربط إلى البكتيريا المختصة كيميائيا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. مرة واحدة مطلية على لوحات المضادات الحيوية، إضافة أربعة ملليلتر من متوسطة النمو مع المضادات الحيوية لثقافة التحول المتبقية للاحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 250 التناوب في الدقيقة الواحدة.
في صباح اليوم التالي، وإعداد الحمض النووي miniprep من الثقافات مزيج الربط بين عشية وضحاها وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وتحديد التركيز الحمض النووي البلازميد الناتجة. لتأكيد خصوصية المستضد للأجسام المضادة المعزولة، transfect 10 ميكروغرام من الحمض النووي miniprep مع كاشف قاعدة الدهون الموجبة في تعليق 10 ملليلتر من 293 خلية. احتضان ثقافة الخلية ثلاثة إلى أربعة أيام في 37 درجة مئوية و 8٪ ثاني أكسيد الكربون و 125 التناوب في الدقيقة الواحدة.
في نهاية الحضانة، الطرد المركزي ثقافة لمدة 10 دقائق في 1000 مرة ز، واستعادة المتوسطة أوضح. قياس تركيز IgG في افرباط عن طريق تقارب للبروتين A واختبار كل جسم مضاد في supernatant في تركيز 25 ميكروغرام لكل ملليلتر من قبل ELISA ضد الببتيدات الفردية المستخدمة لهذا النوع وفقا لبروتوكولات ELISA القياسية. ثم، تأكيد الزيارات إيجابية الشاشة مع ELISA إضافية باستخدام التخفيفات من IgG supernatant لتوليد منحنى تركيز بدءا من 20 ميكرولتر لكل ملليلتر والتآمر ضد الكثافة البصرية لكل مستضد عرض التفاعل إلى الشاشة الأولية ELISA.
لعزل الأجسام المضادة المستضدية المحددة من المتبرعين البشريين ، يمكن ابتكار سلسلة من بوابات القياس للخلايا لعزل الذاكرة المستهدفة بالخلايا. يتم عزل الخلايا الليمفاوية على أساس حجم الخلية و حبيبي، وذلك باستخدام إلى الأمام والجانبية مبعثر. بعد استبعاد doublets والخلايا الميتة، علامات فينوتيبيك تسمح بالفصل من IgG إيجابية CD19-إيجابية B-الخلايا وD27-إيجابية الذاكرة B-الخلايا.
القراءة الأولى من استنساخ خلية واحدة هو تأكيد لتضخيم سلاسل المتغيرات الثقيلة والخفيفة. هنا، مثال على تضخيم فعال جدا من 24 خلية واحدة مع 42٪ الانتعاش الاقتران بعد أن يظهر PCR. بعد استنساخ IgG، يتم نقل متجه التعبير IgG إلى خلايا الكلى الجنينية البشرية 293.
يتم فحص الأجسام المضادة المستردة ضد اللوحة الأصلية من الببتيدات تاو التي تم تسجيلها للتفاعل من قبل ELISA. ثم يتم استكمال تأكيد إضافي باستخدام منحنى تركيز من نفس عينات الأجسام المضادة المؤتلفة ضد الببتيدات التي تم تحديدها في الشاشة الأولية. لكل ضربة إيجابية، يمكن عزل استنساخ بلازميد الفردية من تجمع تحويلها وإعادة تأكيدها من قبل نفس الأسلوب ELISA.
الهدف هو تضخيم تسلسل من خلايا واحدة، لذلك أهم شيء أن نتذكر هو أن أي تلوث سيتم تضخيمها خلال جزء PCR من هذا الإجراء. هذا الإجراء يعطي الأجسام المضادة المؤتلفة البشرية سليمة، والذي يسمح لتنقية والتوصيف الوظيفي للأجسام المضادة بقدر ما كنت ترغب في توليد.
