Dieses Protokoll ist wichtig, weil es verwendet werden kann, um das Immunrepertoire menschlicher Spender zu hinterhören, um seltene, antigenspezifische B-Zellen zu identifizieren. Diese Technik ermöglicht es uns, nativ gepaarte schwere und leichte Ketten zu erhalten, die schnell geklont und dann direkt gegen das Antigen oder Antigene von Interesse getestet werden können. Demonstriert wird das Verfahren von Mike Morton, einem Techniker aus unserem Labor.
Mindestens eine Stunde nach dem Auftauen und erholen, sammeln Sie den Spender PBMC durch Zentrifugation. Und die Zellen in 50 Millilitereiskaltem MES-Puffer zum Zählen wieder aussetzen. Pellet die Zellen durch eine weitere Zentrifugation, und isolieren die CD22-positive B-Zellen durch positive Auswahl mit CD22 Mikroperlen nach Standardprotokollen.
Sammeln Sie die Perlen isolierten CD22-positiven Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie die Zellen viermal 10 bis zu den siebten Zellen pro Milliliter Vax-Pufferkonzentration aus. Fügen Sie den Zellen einen IgG CD19 CD27-Antikörpercocktail gemäß den Verdünnungsempfehlungen des Herstellers mit schonender Mischung hinzu und aliquotieren Sie 10 zu den siebten Zellen in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr für die Negativkontrolle. Fügen Sie dem Negativkontrollröhrchen ein dual beschriftetes Biotin steptavidin Tetramer mit einer Endkonzentration von 36 Nanomolar mit je einem PE und APC hinzu, multipliziert mit der Anzahl der Peptide im Sortierrohr.
Bringen Sie das endige Volumen in jede Röhre 2,5 Milliliter mit frischem Vax-Puffer und fügen Sie die Peptid-Tetramere der Rohrsortierung bei 36 Nanomolar pro PE und APC hinzu. Nach der Zentrifugierung bringen Sie die Zellen auf zwei mal 10 bis 6. pro 100 Mikroliter TBS-Konzentration für eine 30 bis 60 Minuten Inkubation, im Dunkeln, bei vier Grad Celsius, mit Rotation. Am Ende der Inkubation die Zellen zweimal in frischem TBS-Puffer pro Waschgang waschen, bevor sie die Proben in einzelne Fünf-Milliliter-Filterkappenrohre zersieden.
Färben Sie die Proben mit einer 0,3 mikromolaren Endkonzentration von DAPI als Marker der Zellmembranintegrität. Führen Sie den gesamten negativen Steuerelement auf dem Zellsortierer aus, um die Flow-Zytometrie-Gates für die Isolierung der entsprechenden Zellpopulationen für die Einzelzellsortierung festzulegen. Plotten Sie das Antigen PE gegen Antigen APC und setzen Sie das R8-Gate als Antigen PE-positiv und APC-positiver Quadrant mit einer geringen Anzahl von Ereignissen im doppelten positiven Tor.
Sortieren Sie dann die einzelnen CD19-positiven CD27-positiven Antigen PE-positiven, Antigen-APC-positiven Zellen in einzelne Bohrungen einer Master Mix vorbereiteten 96-Well-Platte. Am Ende der Sorte, bedecken Sie die Platte mit Aluminium-Band-Pads, und zentrifugieren Sie die Zellen für eine Minute bei 400 mal g vor minus 80 Grad Lagerung. Um eine umgekehrte Transkriptase-Reaktion durchzuführen, tauen Sie die sortierten B-Zellen auf Eis für zwei Minuten auf, bevor Sie die Platte für zwei Minuten bei 3300 mal g drehen, um den Brunneninhalt vor dem Öffnen an den Boden der Platte zu ziehen.
Nach der Behandlung der Zellen mit einem geeigneten Enzym Master Mix, fügen Sie 2,5 Mikroliter kostenlose DNA als Vorlage für jede PCR-Reaktion, und fügen Sie Primer zu einer endgültigen Konzentration von 1 Mikromolar zu jeder Reaktion. Fügen Sie dann jedem Bohrwert eine 2-fache Konzentration von 10-fachem Polymerasepuffer hinzu, um das Endvolumen auf 25 Mikroliter pro Reaktion zu bringen. Und führen Sie die schweren und leichten PCR-Reaktionen jeweils für 50 Zyklen.
Führen Sie am Ende der Reaktionen die Proben auf 1%Agarose-Gel aus, um die positiven Amplifikationstreffer zu visualisieren. Isolieren Sie sowohl die gepaarten schweren als auch die leichten Kettenreaktionen aus derselben Zelle über die Gelextraktion. Bestimmen Sie die DNA-Fragmentkonzentration durch die optische Dichte bis 60 für genaue Ligationsmixberechnungen.
Kombinieren Sie die wiederhergestellten schweren und leichten Kettenfragmente mit einem Linkerfragment und dem Expression Vector Backbone mit einer Vier-Fragment-Ligationsreaktion gemäß den Anweisungen des Herstellers. Und verwandeln Die Ligationsreaktionen nach den Anweisungen des Herstellers in chemisch kompetente Bakterien. Einmal auf Antibiotikaplatten plattiert, fügen Sie vier Milliliter Wachstumsmedium mit Antibiotika in die verbleibende Transformationskultur für die Inkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius bei 250 Umdrehungen pro Minute hinzu.
Am nächsten Morgen bereiten Sie eine Miniprep-DNA aus den nächtlichen Ligations-Mixkulturen nach den Anweisungen des Herstellers vor und bestimmen die resultierende Plasmid-DNA-Konzentration. Um die Antigenspezifität der isolierten Antikörper zu bestätigen, transfekten Sie 10 Mikrogramm der Miniprep-DNA mit kationischem Lipidbasisreagenz in einer 10 Milliliter Suspension von 293 Zellen. Inkubieren Sie die Zellkultur drei bis vier Tage bei 37 Grad Celsius und 8% Kohlendioxid und 125 Umdrehungen pro Minute.
Zentrifugieren Sie am Ende der Inkubation die Kultur 10 Minuten lang bei 1000 mal g und bergen Sie das geklärte Medium zurück. Messen Sie die IgG-Konzentration im Überstand über die Affinität zu Protein A und testen Sie jeden Antikörper im Überstand mit einer Konzentration von 25 Mikrogramm pro Milliliter durch ELISA mit den einzelnen Peptiden, die für die Sortierung nach Standard-ELISA-Protokollen verwendet werden. Bestätigen Sie dann die positiven Treffer des Bildschirms mit einem zusätzlichen ELISA mit Verdünnungen von IgG-Überstand, um eine Konzentrationskurve ab 20 Mikroliter pro Milliliter zu erzeugen und gegen die optische Dichte für jedes Antigen zu zeichnen, das die Reaktivität zum Ausgangsbildschirm ELISA anzeigt.
Um antigenspezifische Antikörper von menschlichen Spendern zu isolieren, kann eine Reihe von Zytometrie-Gattern entwickelt werden, um das Zielgedächtnis B-Zellen zu isolieren. Die Lymphozyten werden aufgrund ihrer Zellgröße und Granularität isoliert, mit Vorwärts- und Seitenstreuung. Nach dem Ausschluss von Doublets und abgestorbenen Zellen ermöglichen phänotypische Marker die Segregation von IgG-positiven CD19-positiven B-Zellen und CD27-positiven Speicher-B-Zellen.
Die erste Auslesung des einzelzelligen Klonens ist eine Bestätigung der Verstärkung der jeweiligen schweren und leichten variablen Ketten. Hier wird ein Beispiel für eine sehr effiziente Verstärkung aus 24 Einzelzellen mit einer 42%gekoppelten Wiederherstellung nach PCR gezeigt. Nach dem IgG-Klonen wird der IgG-Expressionsvektor in menschliche embryonale Nieren 293 Zellen transspiziert.
Wiederhergestellte Antikörper werden gegen das ursprüngliche Panel von Tau-Peptiden abgeschirmt, die von ELISA auf Reaktivität bewertet wurden. Eine zusätzliche Bestätigung wird dann mit einer Konzentrationskurve der gleichen rekombinanten Antikörperproben gegen die im Ausgangsbild identifizierten Peptide abgeschlossen. Für jeden positiven Treffer kann ein einzelner Plasmidklon aus dem transformierten Pool isoliert und durch die gleiche ELISA-Methode bestätigt werden.
Das Ziel ist die Verstärkung Sequenzen von einzelnen Zellen, so dass das Wichtigste zu erinnern ist, dass jede Kontamination während der PCR-Teil dieses Verfahrens verstärkt werden. Dieses Verfahren liefert intakte humane rekombinante Antikörper, die die Reinigung und funktionelle Charakterisierung von so viel Antikörpern ermöglichen, wie Sie erzeugen möchten.
