Este protocolo é significativo porque pode ser usado para interrogar os repertórios imunológicos de doadores humanos para identificar células B raras e específicas de antígeno. Esta técnica nos permite obter cadeias pesadas e leves com pares nativos, que podem ser rapidamente clonadas, e depois testadas diretamente contra o antígeno ou antígenos de interesse. Demonstrando o procedimento estará Mike Morton, um técnico do nosso laboratório.
Pelo menos uma hora após o descongelamento e recuperação, recolham o PBMC doador por centrifugação. E suspenda as células em 50 mililitros de amortecedor mes frio gelado para contar. Pelotar as células por outra centrifugação, e isolar as células B CD22 positivas por seleção positiva com microesferas CD22 de acordo com os protocolos padrão.
Colete as células cd22-positivas isoladas por centrifugação e resuspense as células em quatro vezes 10 para as sétimas células por mililitro de concentração de buffer Vax. Adicione um coquetel de anticorpos IgG CD19 CD27 às células de acordo com as recomendações de diluição do fabricante com mistura suave, e alíquota de 10 para a sétima célula em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para o controle negativo. Adicione tetramers de tetavidina biotina de dupla denominação ao tubo de controle negativo em uma concentração final de 36 nanomolar cada um com um PE e APC, multiplicados pelo número de peptídeos no tubo de classificação.
Leve o volume final em cada tubo 2,5 mililitros com tampão Vax fresco e adicione os tetramers de peptídeo ao tubo em 36 nanomolar cada PE e APC. Após a centrifugação, leve as células a duas vezes 10 a 6 por 100 microliters de concentração de TBS para uma incubação de 30 a 60 minutos, no escuro, a quatro graus Celsius, com rotação. No final da incubação, lave as células duas vezes em tampão de TBS fresco por lavagem antes de esticar as amostras em tubos individuais de tampa de filtro de cinco mililitros.
Manche as amostras com uma concentração final de 0,3 micromolar de DAPI como marcador de integridade da membrana celular. E execute todo o controle negativo no classificador de células para definir os portões de citometria de fluxo para isolar as populações celulares apropriadas para a classificação de células únicas. Plote o antígeno PE versus antígeno APC e coloque o portão R8 como um antígeno PE positivo, e quadrante APC positivo com um baixo número de eventos no portão duplo positivo.
Em seguida, classifique as células pe-positivas de cd27 positivos cd27-positivos PE-positivo, antígeno APC-positivo em poços individuais de uma placa Master Mix preparada 96 bem. No final do tipo, cubra a placa com almofadas de fita de alumínio e centrífugue as células por um minuto a 400 vezes g antes de menos 80 graus de armazenamento. Para realizar uma reação de transcriptase reversa, descongele as células B classificadas no gelo por dois minutos antes de girar a placa por dois minutos a 3300 vezes g para puxar o conteúdo do poço para o fundo da placa antes de abrir.
Depois de tratar as células com uma enzima apropriada Master Mix, adicione 2,5 microlitros de DNA gratuito como modelo para cada reação pcr, e adicione primers a uma concentração final de 1 micromolar a cada reação. Em seguida, adicione uma concentração de 2X de tampão de polimerase de 10X a cada poço para trazer o volume final para 25 microliters por reação. E executar as reações pcr cadeia pesada e leve cada um por 50 ciclos.
No final das reações, execute as amostras em gel de 1%agarose para visualizar os hits positivos de amplificação. Isole as reações de cadeia pesada e leve emparelhadas da mesma célula através da extração de gel. Determine a concentração do fragmento de DNA pela densidade óptica até 60 para cálculos precisos da mistura de ligadura.
Combine os fragmentos de corrente pesados e leves recuperados com um fragmento de linker e a espinha dorsal do vetor de expressão usando uma reação de ligadura de quatro fragmentos de acordo com as instruções do fabricante. E transformar as reações de ligadura em bactérias quimicamente competentes de acordo com as instruções do fabricante. Uma vez banhado em placas de antibiótico, adicione quatro mililitros de meio de crescimento com antibióticos à cultura de transformação restante para incubação durante a noite a 37 graus Celsius a 250 rotações por minuto.
Na manhã seguinte, prepare um DNA miniprep das culturas de mistura de ligadura durante a noite de acordo com as instruções do fabricante e determine a concentração de DNA plasmídeo resultante. Para confirmar a especificidade do antígeno dos anticorpos isolados, transfete 10 microgramas do DNA miniprep com reagente de base lipídica cônica em uma suspensão de 10 mililitros de 293 células. Incubar a cultura celular de três a quatro dias a 37 graus Celsius e 8% de dióxido de carbono e 125 rotações por minuto.
Ao final da incubação, centrifugar a cultura por 10 minutos a 1000 vezes g, e recuperar o meio esclarecido. Meça a concentração de IgG no supernascer via afinidade com a proteína A e teste cada anticorpo no supernante a uma concentração de 25 microgramas por mililitro por ELISA contra os peptídeos individuais utilizados para o tipo de acordo com os protocolos padrão ELISA. Em seguida, confirme os acertos positivos da tela com um ELISA adicional usando diluições de supernadante IgG para gerar uma curva de concentração a partir de 20 microliters por mililitro e plotando contra a densidade óptica para cada antígeno mostrando reatividade para a tela inicial ELISA.
Para isolar anticorpos específicos de antígenos de doadores humanos, uma série de portões de citometria podem ser criados para isolar as células B da memória alvo. Os linfócitos são isolados com base no tamanho e granularidade da célula, utilizando dispersão para frente e lateral. Após a exclusão de doublets e células mortas, marcadores fenotípicos permitem a segregação de células B de memória B ND19 positivos do IgG positivo e células B de memória CD27 positivas.
A primeira leitura da clonagem de célula única é a confirmação da amplificação das respectivas cadeias variáveis pesadas e leves. Aqui, um exemplo de uma amplificação muito eficiente de 24 células únicas com uma recuperação emparelhada de 42% após a demonstração do PCR. Após a clonagem de IgG, o vetor de expressão IgG é transpectado em células de rim embrionário humano 293 células.
Os anticorpos recuperados são examinados contra o painel original de peptídeos Tau marcados para reatividade por ELISA. A confirmação adicional é então concluída usando uma curva de concentração das mesmas amostras de anticorpos recombinantes contra os peptídeos identificados na tela inicial. Para cada acerto positivo, um clone plasmídeo individual pode ser isolado da piscina transformada e reconfirmado pelo mesmo método ELISA.
O objetivo são amplificar sequências de células únicas, então o mais importante a lembrar é que qualquer contaminação será amplificada durante a porção pcr deste procedimento. Este procedimento produz anticorpos recombinantes humanos intactos, o que permite a purificação e caracterização funcional de tanto anticorpo quanto você deseja gerar.
