وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للسرطان (نسي) المنح U54CA143798 و U54CA143907 لإنشاء مراكز العلوم الفيزيائية للأورام (بس-أوكس) في معهد دانا فاربر للسرطان وجامعة جنوب كاليفورنيا، على التوالي. تلقى سم منتهالر جائزة بس-أوك ترانزيتورك التي دعمت بعض من هذا العمل. نود أن نعرب عن عميق امتناننا للداعمين الخيرية، وخاصة عائلة ستيفنسون، ايميت، توني وتيسا، على تبرعهم من منصة أوبيريت هس. نود أيضا أن نشكر J. فو للإرشاد، ومركز أعضاء فريق الطب الجزيئي التطبيقي: D. أغوس للتوجيه والإرشاد السريري، K. باتسش للمناقشات ذات مغزى مع تصميم التجريبية، ر روات للمساعدة في بروتوكولات تحليل الصور ، J. كاتس للمساعدة التقنية مع أوبيرا، و P. ماكلين و D. روديرمان للمناقشات مفيدة وردود الفعل.

1. خلية الثقافة ملاحظة: هنا تم التحقيق الاستجابات الظواهر من الخلايا نسكلك (H3255) إلى وكيل استهداف إغفر، إرلوتينيب، عندما شارك في مثقف مع الخلايا الليفية الرئة (كسد-19Lu غفب). لنفس مجموعة البيانات، ومقرها مضان والتصنيف القائم على التشكل من السكان خلية اثنين (H3255 و كسد-19Lu غفب) لتجسيد التوافق. ومع ذلك، لا بد من استخدام أسلوب تصنيف واحد فقط وينبغي اختياره بناء على التطبيق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 500 مل من رمي-1640 تستكمل مع 10٪ فبس المعطل الحرارة و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين. ملاحظة: يمكن استبدال المتوسطة النمو والمكملات الغذائية كما هو مطلوب لأنواع الخلايا الأخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الثقافة في 10 سم 3 لوحات كما السكان النقي في 5٪ كو 2 عند 37 درجة مئوية والمرور في نسبة مناسبة كل 3-4 أيام. </li></ol> 2. إعداد الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد تعليق خلية، وإزالة جإل وسائل الإعلام وغسل الخلايا مع 5 مل 1X الفوسفات مخزنة المالحة (بس). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح قبالة برنامج تلفزيوني، إضافة 1 مل من 0.05٪ التربسين تحسنت إلى 37 درجة مئوية واحتضان لمدة 5 دقائق (أو حتى الخلايا لم تعد التمسك لوحة) عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحييد التربسين، إضافة 4 مل من رمي إلى H3255 و كسد-19Lu غفب لوحات والماصة حلول الخلايا إلى 15 مل أنابيب مخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الطرد المركزي في 150 x ج لمدة 5 دقائق في رت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح قبالة طاف و ريسوسبيند الكريات خلية في 10 مل من وسائل الإعلام رمي في أنابيب مخروطية للتحضير للبذر. </li></ol> 3. خلية تصفيح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا لتوحيد البذر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس أنابيب لخلط الخلايا في الحل. ماصة 10 ميكرولتر من كل تعليق خلية في أنبوب ميكروسنتريفوج وإضافة 10 ميكرولتر الأزرق التريبان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 10 ميكرولتر من هذا الحل في شريحة العد الخلية وإدراجها في عداد الخلية الآلي. ملاحظة: طرق أخرى من عد الخلايا ( أي. عدادة الكريات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر عدد الخلايا ثلاث مرات على الأقل، أو حتى يتم الحصول على التهم التي يتم الحصول عليها. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا البذور على لوحة متعددة جيدا ملاحظة: عدد لوحات البذور يعتمد على عدد من النقاط الزمنية التي سيتم تصويرها. بدلا من ذلك، لوحة واحدة يمكن إعادة تصويرها مع مرور الوقت إذا تم ترانزدوسد الخلايا مع هيستون-2B-غفب (أو غيرها من البقع النووية لنتيفيرال مستقرة التي توفر تجزئة النووية كافية). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور ما مجموعه 1500 خلية / جيدا في 100 ميكرولتر من رمي. إعداد ثلاثة تعليق خلية إلى لوحة ثلاثة سكان الخلية: H3255، كسد-19Lu غفب، و 50٪ H3255 + 50٪ كسد-19Lu غفب. أداء كل في ثلاث نسخ مع الاجهزة لوحة متطابقة لكل نقطة زمنية. ملاحظة: يجب أن تكون الأمثل الكثافة البذر الأولية لكل خط الخلية وحجم اللوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا البذور في لوحات 3 × 96 جيدا باستخدام ماصة الأقنية. احتضان الخلايا O / N عند 37 درجة مئوية، 5٪ كو 2 . </li></ol> &lt;/ لى&gt; </ol> 4. المخدرات الجرعات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة دمسو إلى مسحوق إرلوتينيب لجعل الحل النهائي إرلوتينيب الأسهم من تركيز 10 ملم. ملاحظة: الدواء يمكن أن تكون بديلا كما هو مطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع المخدرات مع وسط ثقافة الخلية إلى 2X التركيز النهائي مع أعلى تركيز النهائي في 10 ميكرومتر وتسلسل تمييع أربع مرات في نسبة 01:10، لما مجموعه خمسة تركيزات المخدرات وعدم وجود مراقبة المخدرات. ملاحظة: إذا كان تركيز دمسو يساوي أو يتجاوز 0.1٪ v / v في أعلى جرعة الدواء، لا ينبغي أن تحتوي على أي مكافحة المخدرات على كمية مماثلة من دمسو لضمان الآثار الملاحظة لوحظ لا يرجع إلى سمية دمسو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 100 ميكرولتر من محلول المخدرات في البئر المناسب لتركيز الدواء النهائي من 1X المخفف في وسائل الإعلام. </li></ol> 5. صورة اكتساب ملاحظة: تم الحصول على الصور في أيام 0 و 2 و 3. اعتمادا على أنواع الخلايا والعمليات الخلوية التي يجري دراستها، سيمكن دراسة نقاط الوقت المطلوبة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا وصمة عار للتحضير للتصوير. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكل الحل صبغ في التركيزات النهائية التالية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتصنيف القائم على مضان، وإعداد 5 ميكروغرام / مل وصمة عار النووية و 5 ميكرومتر وصمة عار خلية ميتة في برنامج تلفزيوني (انظر جدول المواد ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتصنيف القائم على التشكل، وإعداد 5 ميكروغرام / مل وصمة عار النووية، 5 ميكرومتر وصمة عار خلية ميتة، و 5 ميكرومتر وصمة عار الخلية في برنامج تلفزيوني (انظر جدول المواد ). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر حل صبغ لكل بئر. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية المحمية من الضوء. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحسين والحصول على الصور. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة جيدا من حاضنة، يمسح الجزء السفلي من لوحة مع 70٪ إتوه، ووضع لوحة في غرفة التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في علامة التبويب &quot;إعداد&quot;، انقر على الزر &quot;+&quot; ضمن &quot;تحديد القناة&quot; لإضافة قنوات مناسبة إلى( أي برايتفيلد، وصمة عار النووية، وصمة عار الخلية الميتة، غفب، وإشارات رفب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر فوق &quot;اختيار تخطيط&quot;، واتخاذ صور اختبار مكدسة ض كل 2 ميكرون بدءا من 0 ميكرون وتنتهي في 20 ميكرون لتحديد الطائرة من التركيز. أدخل هذه المسافة لكل قناة ضمن &quot;الارتفاع&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر فوق &quot;لقطة&quot; تحت كل قناة لتقييم الشدة وتحسين أوقات التعرض. أدخل قيم أعلى أو أقل ضمن &quot;الوقت&quot; كما هو مطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الجانب الأيمن من الشاشة، وتسليط الضوء الآبار المناسبة (ليتم تصويرها) على لوحة التخطيطي. في الآبار التخطيطي أدناه، تسليط الضوء على الحقول الخمسة والعشرين ليتم تصويرها بطريقة مماثلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت &quot;تشغيل التجربة&quot;، وتحديد لوحة في &quot;اسم اللوحة&quot; على علامة التبويب اليسرى، وانقر على زر &quot;ابدأ&quot; (تحتها) لتشغيل بروتوكول الحصول على الصور مع هدف 10X لتوليد الصور تيف الرمادية في القنوات المذكورة أعلاه. ملاحظة: خطوة بخطوة إنستقد تختلف الاختلافات لبروتوكول التصوير بين الأدوات، ولكن يجب أن تظل القيم المعلمة الأمثل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر التصوير على أيام اثنين وثلاثة. </li></ol></li></ol> 6. تحليل الصورة ملاحظة: تم تنفيذ جميع تحليل الصور باستخدام البرمجيات الملكية. ومع ذلك، ولأن هذه ليست متاحة للجمهور، تم تصميم تحليلات مماثلة أيضا على سيلبروفيلر 2.2 ومحلل سيلبروفيلر 2.0، مع بروتوكول موجز المدرجة أدناه والبروتوكول مفصلة كمادة تكميلية (صور الاختبار هي بالفعل تحميلها في خطوط الأنابيب لاختبار سير العمل). تم تجميع الصور من هذه التجربة معا على أساس كل جيدا بحيث يمكن تحميل كل بئر بشكل فردي. تحتوي خطوط أنابيب سيلبروفيلر أدناه على تعبير منتظم يقوم بتحليل معلومات البيانات الوصفية من كل اسم ملف صورة ويسمح بتجميع الصور بشكل أكبر حسب القناة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل وتثبيت برنامج مفتوح المصدر: &#39;سيلبروفيلر9؛ و &quot;محلل سيلبروفيلر&quot;. قبول كافة الخيارات والإضافات الافتراضية أثناء التثبيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصنيف الثقافات غير المتجانسة إلى مجموعات سكانية فرعية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> افتح البرنامج &#39;سيلبروفيلر&#39;، انقر فوق &#39;ملف&#39; | &#39;خط أنابيب الاستيراد&#39; | &#39;من ملف&#39;، وحدد الملف المناسب (&quot;Fluorescence_Classification.cppipe&quot; للتصنيف القائم على مضان ، أو &quot;Morphology_Classification.cppipe&quot; للتصنيف القائم على التشكل). ملاحظة: تحتوي هذه الملفات على بروتوكولات لمعالجة الصور الأساسية وتجزئة النوى / الخلية. بسبب متفاوتة هوشست وصمة عار الحاضر عبر هذه الخلايا، كانت مجزأة نواة ومكبرة، ثم تستخدم لإخفاء الصورة للسماح لتجزئة نوى مع كثافة أقل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد خط أنابيب التصنيف القائم على مضان لتصنيف الخلايا إما H3255 أو كسد-19Lu على أساس كثافة إغف، وحساب ميزات التشكل. ملاحظة: كسد-19Lu كانت الخلايا ترانزدوسد مع غفب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد خط أنابيب تصنيف المستندة إلى التشكل لتقسيم النوى والخلايا، وحساب ميزات التشكل. ملاحظة: هناك حاجة إلى مزيد من التحليل المصب في &quot;محلل سيلبروفيلر&quot; للتصنيف. وتصنف الخلايا الميتة عن طريق التصنيف القائم على مضان. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر فوق &quot;عرض إعدادات الإخراج&quot; في الجزء السفلي الأيسر من الشاشة. حدد موقع ملفات الصور للتحليل (&#39;مجلد الإدخال الافتراضي&#39;) ووجهة البيانات المستخرجة (&#39;مجلد الإخراج الافتراضي&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر فوق &quot;تحليل الصور&quot; لبدء التحليل. عند اكتمال التحليل، انقر فوق &quot;موافق&quot; وانتقل إلى &quot;مجلد الإخراج الافتراضي&quot; لعرض البيانات المحسوبة. ملاحظة: قيم معلمات المثال والصور متوفرة في الملف التكميلي 1-CellProfilerProtocol.pdf . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتصنيف القائم على التشكل (فقط) القيام بما يلي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح برنامج &#39;سيلبروفيلر محلل&#39;، حدد ملف خصائص قاعدة البيانات التي تم إنشاؤها في سيلبروفيلر، ثم انقر فوق &#39;فتح&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على علامة التبويب &quot;المصنف&quot; في الجزء العلوي الأيمن من الشاشة. لاستدعاء الصور خلية عشوائية من التجربة، انقر فوق &quot;جلب&quot;. ستظهر الصور في النافذة غير المصنفة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصنيف الخلايا يدويا كما إيجابية (H3255) أو سلبية (كسد-19Lu) عن طريق تحديد وسحب الخلايا إلى بن مناسب (انظر الملف التكميلي 2-Pipeline.pdf : الشكل B ). بعد تصنيف ما لا يقل عن 50 خلية لكل مجموعة فرعية، انقر فوق &quot;تصنيف المصنف&quot;، ثم انقر فوق &quot;تحقق التقدم&quot;. ملاحظة: يتم تصنيف الخلايا عن طريق خوارزمية التعلم آلة الغابات التي يشرف عليها المستخدم عشوائية 12 . إذا لم تكن الدقة فوق العتبة المعتمدة (&gt; 90٪)، قد يكون من الضروري العودة وتحسين تجزئة الخلايا على &#39;سيلبروفيلر&#39;، أو قد لا تكون الخلايا مثالية للكلاسيمن خلال التشكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر فوق &quot;نقاط الكل&quot; لإنشاء جدول مع التهم الخلية لكل فئة فرعية. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kanemura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+in+vitro+proliferative+activity+of+human+fetal+neural+stem/progenitor+cells+using+indirect+measurements+of+viable+cells+based+on+cellular+metabolic+activity.">Evaluation of in vitro proliferative activity of human fetal neural stem/progenitor cells using indirect measurements of viable cells based on cellular metabolic activity.</a> J Neurosci Res. 69 (6), 869-879 (2002).</li><li>Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+pH+dependence+of+3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium+bromide-formazan+absorption+on+chemosensitivity+determined+by+a+novel+tetrazolium-based+assay.">Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay.</a> Cancer Res. 49 (16), 4435-4440 (1989).</li><li>Hsu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+tea+polyphenols+induce+differentiation+and+proliferation+in+epidermal+keratinocytes.">Green tea polyphenols induce differentiation and proliferation in epidermal keratinocytes.</a> J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 29-34 (2003).</li><li>Caicedo, J. C., Singh, S., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+in+image-based+profiling+of+perturbations.">Applications in image-based profiling of perturbations.</a> Curr Opin Biotechnol. 39, 134-142 (2016).</li><li>Sero, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+and+the+microenvironment+regulate+nuclear+translocation+of+NF-kappaB+in+breast+epithelial+and+tumor+cells.">Cell shape and the microenvironment regulate nuclear translocation of NF-kappaB in breast epithelial and tumor cells.</a> Mol Syst Biol. 11 (3), 790 (2015).</li><li>Chen, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclassification+of+prostate+cancer+circulating+tumor+cells+by+nuclear+size+reveals+very+small+nuclear+circulating+tumor+cells+in+patients+with+visceral+metastases.">Subclassification of prostate cancer circulating tumor cells by nuclear size reveals very small nuclear circulating tumor cells in patients with visceral metastases.</a> Cancer. 121 (18), 3240-3251 (2015).</li><li>Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+heterogeneity+in+the+cancer+wound.">Fibroblast heterogeneity in the cancer wound.</a> J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).</li><li>Paraiso, K. H., Smalley, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast-mediated+drug+resistance+in+cancer.">Fibroblast-mediated drug resistance in cancer.</a> Biochem Pharmacol. 85 (8), 1033-1041 (2013).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+fibroblasts+in+cancer.">The biology and function of fibroblasts in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+Analyst:+data+exploration+and+analysis+software+for+complex+image-based+screens.">CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens.</a> BMC Bioinformatics. 9, 482 (2008).</li><li>Dao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+Analyst:+interactive+data+exploration,+analysis+and+classification+of+large+biological+image+sets.">CellProfiler Analyst: interactive data exploration, analysis and classification of large biological image sets.</a> Bioinformatics. 32 (20), 3210-3212 (2016).</li><li>Garvey, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+image-based+method+for+quantitatively+studying+context-dependent+cell+population+dynamics.">A high-content image-based method for quantitatively studying context-dependent cell population dynamics.</a> Sci Rep. 6, 29752 (2016).</li><li>Juarez, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+differences+in+cell+line+population+dynamics+using+CellPD.">Quantifying differences in cell line population dynamics using CellPD.</a> BMC Syst Biol. 10 (1), 92 (2016).</li><li>Mumenthaler, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Microenvironmental+Heterogeneity+on+the+Evolution+of+Drug+Resistance+in+Cancer+Cells.">The Impact of Microenvironmental Heterogeneity on the Evolution of Drug Resistance in Cancer Cells.</a> Cancer Inform. 14, 19-31 (2015).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates14. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.
Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features. 
For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately. 
While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations. 
In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors13,15.

وكانت المقايسات القائمة على الخلايا عاملا أساسيا في البحوث الأساسية وإعدادات المخدرات المخدرات. ومع ذلك، فإن القيود المفروضة على هذه المقايسات القياسية أصبحت واضحة على نحو متزايد مع التناقض بين في المختبر والبيانات السريرية وفشل معظم الأدوية للحصول على موافقة ادارة الاغذية والعقاقير. هنا، نقدم طريقة جديدة لاستخدام التصوير الكمي لتحليل في وقت واحد الظواهر غير المتجانسة ردا على المحفزات البيئية ذات الصلة، التي تحدث المشتركة. المقايسات القائمة على الخلية التقليدية التي تستخدم لقياس بقاء الخلية ما يلي: المقايسات استبعاد التريبان الأزرق، مت / متس، والملحق V- فيتس تلطيخ الخلوي التدفق. تريبان المقايسات استبعاد الأزرق، في حين بسيطة وغير مكلفة، تتطلب عددا كبيرا من الخلايا، وتستغرق وقتا طويلا، وغالبا ما تتأثر التحيز المستخدم 1 . مت و المقايسات متس قياس غير مباشر بقاء الخلية من خلال قياسات معدل الأيض الميتوكوندريا. ومع ذلك، فإن النشاط الأيضيتي من الخلايا يمكن أن تتأثر ظروف الثقافة المختلفة (مثل وسائل الإعلام أو تركيز الأكسجين)، الأمر الذي يؤدي إلى نتائج غير دقيقة ويمنع التوحيد عبر أنواع الخلايا والشروط 2 ، 3 . عيب رئيسي آخر من هذه التقنيات هو عدم قدرتها على التمييز بين أنواع الخلايا متعددة - معظم النظم البيولوجية هي هيتيروسلولار. في حين أن أساليب التدفق الخلوي لديها القدرة على التمييز بين السكان خلية متعددة، مطلوب تسميات الخلية، أخذ العينات ديناميكية صعبة، وعند استخدام الخلايا الملتصقة، يصبح هذا التطبيق تستغرق وقتا طويلا والخطأ عرضة. تحدث المظاهر الخلوية الهامة الأخرى، بما في ذلك التغيرات المورفولوجية، استجابة للمؤثرات البيئية ولكن لا يتم التقاطها بواسطة المقايسات التقليدية القائمة على الخلية. التنميط الحالات الخلية من خلال توصيف المورفولوجية ورسم خرائط أوجه التشابه عبر العينات هو أداة قوية وغير منحازة مع أبيليتي لتقديم رؤى جديدة في العديد من جوانب البحوث الأساسية والترجمة، بما في ذلك البيولوجيا الخلية الأساسية واكتشاف المخدرات 4 . وعلاوة على ذلك، وقد ثبت مورفولوجيا الخلايا السرطانية لربط مع الأنواع الفرعية الورم 5 والعدوانية 6 . وبالتالي، فمن مصلحة كبيرة لدراسة هذه الميزات الخلوية وكيفية ارتباطها الاضطرابات البيئية محددة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن استخدام الاختلافات في السمات المورفولوجية للتمييز بين المجموعات السكانية الفرعية في نظم الثقافة المشتركة. فلوريسنتلي الخلايا وضع العلامات لديه شلالات ( أي تغيير خصائص الخلايا الكامنة، تستغرق وقتا طويلا) وبالتالي أساليب إضافية لتصنيف أنواع الخلايا هي مفيدة. التصوير القائم على الفحص المجهري هو طريقة بديلة لتحديد المظاهر الخلوية بطريقة متعددة، وكمية، وقوية. في هذه المخطوطة، نطبق خط أنابيب التصوير الكمي لتسليط الضوء على إفولوتيوديناميات ناري من السكان الخلايا غير متجانسة داخل الورم. ونحن نركز على التفاعل بين الخلايا غير الصغيرة سرطان الرئة الخلايا (نسكلك) والخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (كافس)، الأكثر انتشارا نوع الخلايا اللحمية وجدت في الأورام. وقد تورط كافس في بدء الورم، والتقدم، والاستجابة العلاجية. وبالتالي، وإجراء المقايسات المظهري على الخلايا السرطانية في غياب كافس يمكن أن يكون مضللا 7 ، 8 ، 9 . على وجه التحديد، قمنا بتقييم آثار كافس على الخلايا السرطانية ردا على إرلوتينيب، وهو جزيء صغير يستهدف البشرة عامل النمو مستقبلات (إغفر) التي غالبا ما تستخدم في العلاج السريري لل نسكلك. لقد استخدمنا منصة فحص عالية المحتوى وبرامجها المصاحبة لتحليل الصور للتقييم؛ ومع ذلك، في محاولة لجعل هذه المنهجية في متناول الباحثين الآخرين وضعنا أيضا بروتوكول المصب مماثلة باستخدام البرمجيات مفتوحة المصدر:سيلبروفيلر 10 و سيلبروفيلر محلل 11 . يتم تحليل معظم المقايسات فحص عالية المحتوى القائم على صورة مع البرمجيات التجارية محددة لنموذج صك معين. النتائج يصعب تكرارها في مختبرات أخرى مع برامج مختلفة لأن الخوارزميات الكامنة غالبا ما تكون ملكية. باستخدام هذه الأنابيب القائمة على الصورة، تم قياس تكاثر الخلايا، والموت، والتشكل من كل مجموعة فرعية من ثقافة مغاير استجابة للعلاج من تعاطي المخدرات باستخدام كل من الفلورسنس والتصنيف القائم على التشكل. يوفر البروتوكول التالي منهجية قوية للبحث في العمليات الخلوية المعقدة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="677">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-040-CV</td>
			<td style="width:191px;">cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">FBS</td>
			<td style="width:127px;">Gemini</td>
			<td style="width:119px;">100-106</td>
			<td>medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15-140-122</td>
			<td>medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">TC20</td>
			<td style="width:127px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1450102</td>
			<td>cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">TC20 slides with trypan blue</td>
			<td style="width:127px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1450003</td>
			<td>cell counter slides</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">96-well plates</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3904</td>
			<td>clear bottom black plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Erlotinib</td>
			<td style="width:127px;">LC Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">E-4007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">DMSO</td>
			<td style="width:127px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">317275-100ML</td>
			<td>solution to resuspend drug</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Hoechst</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">H21491</td>
			<td>nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td>dead cell stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">Cell Tracker Orange CMRA</td>
			<td style="width:127px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C34551</td>
			<td>whole cell stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">Operetta high content imaging system</td>
			<td style="width:127px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">CellProfiler</td>
			<td style="width:127px;">Broad Institue</td>
			<td style="width:119px;">version 2.2.0 (rev 9969f42)</td>
			<td>http://cellprofiler.org/releases/</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:240px;">Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:191px;">Any cell culture incubator will be suitable - cells were cultured under 37 &#186;C at 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">15 mL Falcon conical tubes</td>
			<td style="width:127px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:240px;">10 cm2 cell culture plates</td>
			<td style="width:127px;">TPP</td>
			<td>93040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimination and characterization of heterocellular populations using quantitative imaging techniques

العمليات الخلوية معقدة وتنتج عن التفاعل بين أنواع الخلايا المتعددة وبيئتها. غالبا ما لا تسمح تقنيات البيولوجيا الخلوية الحالية بتفسير دقيق لهذا التفاعل. باستخدام نهج الكمي القائم على التصوير، نقدم بروتوكول عالية المحتوى لتوصيف الاستجابات الظاهرية الديناميكية ( أي تغيرات مورفولوجيا، وانتشار، موت الخلايا المبرمج) من السكان الخلايا غير المتجانسة للتغيرات في المحفزات البيئية. نحن نسلط الضوء على قدرتنا على التمييز بين أنواع الخلايا على أساس إما كثافة مضان أو ملامح مورفولوجيا الأصيلة اعتمادا على التطبيق. هذه المنصة تسمح لتوصيف أكثر شمولية من استجابة السكان الفرعي للاضطراب أثناء استخدام وقت أقصر، كميات صغيرة من الكواشف، وانخفاض احتمال الخطأ من المقايسات البيولوجيا الخلية التقليدية. ومع ذلك، في بعض الحالات، قد يكون من الصعب تحديد السكان الخلية و كوانتيتات على أساس الخلوية المعقدةلير وسوف تتطلب المزيد من استكشاف الأخطاء وإصلاحها. ونحن نسلط الضوء على بعض هذه الظروف في البروتوكول. علينا أن نظهر هذا التطبيق باستخدام الاستجابة للدواء في نموذج السرطان. ومع ذلك، فإنه يمكن بسهولة أن تطبق على نطاق أوسع إلى العمليات الفسيولوجية الأخرى. يسمح هذا البروتوكول واحد لتحديد الفئات السكانية الفرعية داخل نظام الثقافة المشتركة وتوصيف استجابة معينة من كل إلى المحفزات الخارجية.

أنشأنا مجموعة صور تتألف من 25 حقل / جيدا، 54 بئرا / لوحة (3 خلايا السكان × 6 تركيزات المخدرات × 3 مكررات)، عبر ثلاث لوحات لما مجموعه 4050 الصور الفردية. تم تحليل مجموعات الصور التي تم إنشاؤها على مدى التجربة باستخدام البرمجيات الملكية (انظر جدول المواد) لاستخراج مختلف الخصائص الكمية للخلايا ( أي التشكل، مضان) والتي يمكن أن تستخدم بعد ذلك لتصنيف المجموعات السكانية الفرعية الخلية. ومع ذلك، لأن البرامج التجارية المستخدمة لديها وصول محدود، تم إنشاء خطوط الأنابيب المصب مماثلة في سيلبروفيلر ومحلل سيلبروفيلر. تصنيف غير متجانسة إلى مجموعات سكانية فرعية تم تحديد النوى وتجزئة على أساس وصمة عار الحمض النووي (هنا هويشت) وتصنيف السكان الخلية إما على أساس مضان أو موريفولوجي ( الشكل 1 ). لتصنيف القائم على مضان، كانت الخلايا الليفية (كسد-19Lu) ترانزدوسد سابقا مع غفب-لنتيفيروس. تم قياس مستويات كثافة غفب لكل نواة، وتلك التي تم حسابها فوق العتبة المقبولة (استنادا إلى إشارة الخلفية) تم تصنيفها على أنها كسد-19Lu بينما تم تحديد تلك أدناه كخلايا ورم (H3255). للتصنيف القائم على التشكل، كانت الخلايا ملطخة سابقا مع وصمة عار الخلوية غير سامة (انظر الجدول من المواد)، وكان هذا لتحديد وتجزئة السيتوبلازم. تم تدريب خوارزمية التعلم الآلي مع الخلايا ~ 50-100 من كل السكان. تم التعرف على الخصائص المورفولوجية التي كانت مختلفة بشكل كبير بين السكان، والتي كانت تستخدم بعد ذلك لتصميم مصنف خطي للتمييز بين خلايا كسد-19Lu و H3255. كانت مضان والبروتوكولات تصنيف التشكل 97.4٪ (ن = 1403) متماثلة في التمييز بين اثنين من الخلايا بوبولالأفيونات في ظروف غير المعالجة و 92.5٪ (ن = 916) متفق في ظروف علاج المخدرات (1 ميكرومتر إرلوتينيب) ( الشكل 2 ). التحاليل النمطية للقطاعات الفرعية بالإضافة إلى التمييز بين أنواع الخلايا، ونحن تهدف إلى تميز الخصائص الظاهرية لكل فئة فرعية. مضاعفات المقايسات يوفر الوقت والكواشف، ويضيف الاتساق، ويوفر معلومات إضافية بشأن النظام قيد الدراسة. هناك العديد من النواتج المظهرية المحتملة، وينبغي للمرء أن يختارها على أساس الأسئلة ذات الاهتمام. هنا، تم التحقيق في التغيرات في مورفولوجيا الخلية وحالة البقاء على قيد الحياة ردا على علاج إرلوتينيب. بعد ثلاثة أيام من العلاج من تعاطي المخدرات، لوحظ انخفاض في المنطقة النووية وزيادة في المنطقة الخلوية للخلايا H3255 ( الشكل 3A ). متوسط ​​الفرق في المجال النووي بينتم العثور على &quot;غير مخدر&quot; و &quot;المخدرات&quot; السكان المعالجة أن تكون ذات دلالة إحصائية عن طريق نوع من جانبين من 2 (التباين المساواة) t -test ( p = 7.92 × 10 -16 ). نحن نفترض أن هذه الملاحظة هي استجابة الخلوية إلى الإجهاد المفروضة من قبل العلاج من تعاطي المخدرات. ومن المهم أيضا دراسة ما إذا كان الدواء له سامة للخلايا ( أي زيادة في عدد الخلايا الميتة مع مرور الوقت) أو تثبيط الخلايا ( أي انخفاض في عدد الولادات الخلوية مع مرور الوقت) تأثير على الخلايا، وهذا له تأثير سريري عميق. على سبيل المثال، تأثير المخدرات تثبيط الخلايا يؤدي إلى اعتقال النمو حتى الآن لا يلغي الخلايا من الورم، وبالتالي هناك إمكانية للخلايا السرطانية لإعادة التكاثر الخلايا مرة واحدة يتم إزالة المخدرات. آثار المخدرات غالبا ما يكون السياق، والتركيز، ونوع الخلية تعتمد. لاحظنا سابقا إرلوتينيب استحضار استجابة السامة للخلايا في نوع واحد من الخلايا، في حين تبين أساستجابة الارتجاع في 13 آخر. اختبارات المقايسة التقليدية الناتج عدد الخلايا النسبية، وبالتالي، لا تميز بين الاعتقالات النمو والموت الخلية. هنا، تم تحديد الخلايا الميتة على أساس وصمة عار يوديد بروبيديوم ( الشكل 3B ). وقد لوحظت كل من السامة للخلايا وآثار تثبيط الخلايا من إرلوتينيب على خلايا H3255، مع زيادة في عدد الوفيات وانخفاض في عدد الولادات بعد العلاج من تعاطي المخدرات ( الشكل 3C ). ومن الجدير بالذكر أن عدد الخلايا الميتة يسقط بعد يوم 1 المرجح بسبب إزالة الخلايا. لم تتأثر خلايا كسد-19Lu من المخدرات. ميزة إضافية من هذا المنبر هو توليد البيانات الكمية. على سبيل المثال، في تجربتنا في الثقافة المشتركة، تم العثور على مجموعة فرعية أولية من 1،118 (75.8٪) H3255 الخلايا لتكون 2،817 (87.9٪) أو 396 (57.2٪) بعد ثلاثة أيام دون أو مع إرلوتينيب العلاج، على التوالي ( الشكل 4 ). لأننا يمكن أن تولد التهم الخلية الفعلية بدلا من النسبة المئوية النسبية (كما هو الحال مع أساليب التدفق الخلوي)، نستنتج أن التغيير في تكوين خلال العلاج من تعاطي المخدرات ويرجع ذلك إلى انخفاض في خلايا H3255 وليس زيادة في كسد-19Lu. ومن الجدير بالذكر أن معدلات الوفيات قد يكون التقليل من شأنها بسبب إزالة الخلايا، وهو أمر صعب لتقييم تجريبيا ومن المرجح أن تختلف عبر أنواع الخلايا. <img alt="شكل 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig1.jpg" /> الشكل 1: نظرة عامة على بروتوكول تحليل الصور. اثنين من خطوط أنابيب تحليل الصور المصب المحتملة لتصنيف السكان غير المتجانسة باستخدام إما التصنيف القائم على التشكل أو التصنيف القائم على الفلورسنس. الحانات مقياس = 100 ميكرون. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر عليها</a>ه لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig2.jpg" /> الشكل 2: التوافق بين التشكل والتصنيف القائم على مضان. ( A ) مؤامرة التوافق عرض التداخل لبروتوكولات التصنيف اثنين. تم تصنيف الخلايا نفسها على أنها H3255 باستخدام كل من التشكل- مورفولوغي ومقرها مضان. تم الاتفاق على اثنين من البروتوكولات، مع تصنيف 97.4٪ (n = 1403) من الخلايا غير المعالجة و 92.5٪ (ن = 916) من الخلايا تعامل مع إرلوتينيب (ملاحظة: منطقة بيضاء صغيرة جدا لتصور). ( B ) 10X الصور التي تصور أمثلة من التوافق الجيد والفقير بين القائم على مضان والتصنيف القائم على التشكل. تشير الأسهم البيضاء إلى الخلايا التي تم تصنيفها بشكل غير متسق بين المنصات. إدخال الصورة: الأزرق - نوى (هوشست). الأخضر - CCD19Lu (غفب). المصنفةفيكاتيون الصور: الأحمر - H3255. الأخضر - كسد-19Lu. شريط مقياس = 100 ميكرون. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig3.jpg" /> الشكل 3: القياسات النمطية المضاعفة من إعداد تجريبي واحد. ( أ ) تم حساب الخصائص المورفولوجية، مثل النوى ومنطقة الخلية، على مستوى الخلية الواحدة في وجود وغياب المخدرات. ملاحظة: اعتبرت المناطق الخلوية التي يقل حجمها عن 100 ميكرومتر 2 حطام واستبعدت من التحليلات. مؤامرة مربع يصور الوسيط مع النطاقات الرباعية الأولى والثالثة و 95٪ أشرطة الخطأ الفاصل الثقة. ( B ) H3255 (الأزرق) و كسد-19Lu (الأخضر) خلايا شارك في تربيتها وتم تحديد الخلايا الميتة على أساس كثافة بروبيدأيوم يوديد وصمة عار (الأحمر) وتصويرها باستخدام هدف 10X. شريط مقياس = 1 مم (اللوحة العليا)؛ 100 ميكرون (الصور القاع). ( C ) تم حساب إجمالي عدد الخلايا الحية والميتة على مدى ثلاثة أيام مع أو بدون العلاج من تعاطي المخدرات، مع انخفاض واضح في عدد الخلايا الحية وزيادة في الخلايا الميتة مع إضافة إرلوتينيب. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ القياسي للمتوسط ​​استنادا إلى ثلاث مكررات. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig4.jpg" /> الشكل 4: الديناميات السكانية الفرعية على مر الزمن. ممثل صور 10X من الآبار التي تحتوي على H3255 (الأزرق) و كسد-19Lu (الأخضر) في يوم 0 أو يوم 3 مع وبدون المخدرات. تم حساب الخلايا التي تنتمي إلى كل سكانية فرعية والرسوم البيانية الدائرية النسبية أكتوال في التركيبة السكانية عبر العينات. مقياس الحانات = 1 ملم (لوحات الأوسط، شبون في؛ لوحة إفتموست)، 1 مم (أعلى صورة)، 100 ميكرون (الصور القاع). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques at JoVE.com

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

قمنا بتطوير بروتوكول جديد لدراسة الديناميات السكانية غير المتجانسة في الاستجابة للاضطرابات. تصف هذه المخطوطة منصة تعتمد على التصوير تنتج مجموعات بيانات كمية لتوصيف في وقت واحد من المظاهر الخلوية متعددة من السكان غير المتجانسة بطريقة قوية.

التمييز وتوصيف السكان غير المتجانسة باستخدام تقنيات التصوير الكمي

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...

discrimination-characterization-heterocellular-populations-using

Research

JoVE Journal

Biology

7.4K Views.  University of Southern California (USC).  قمنا بتطوير بروتوكول جديد لدراسة الديناميات السكانية غير المتجانسة في الاستجابة للاضطرابات. تصف هذه المخطوطة منصة تعتمد على التصوير تنتج مجموعات بيانات كمية لتوصيف في وقت واحد من المظاهر الخلوية متعددة من السكان غير المتجانسة بطريقة قوي...

Video: Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

تعيش خلية التصوير والتحليل الكمي من الخلايا الظهارية في الجنينية القيطم المورق</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

تقنيات التصوير كاليفورنيا 2 + في اشارة الى الحيوانات المنوية البشرية

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

تحديد وتوصيف ارتباط بالغليكوزيل باستخدام بروتين معين إندو وexoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

التحليل الكمي الالتهام الذاتي باستخدام المجهر مضان المتقدم 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

قياس الكالسيوم داخل الخلايا<sup&gt; 2 +</sup&gt; التغييرات في الحيوانات المنوية البشرية باستخدام تقنيات أربعة: قياس التألق التقليدية، وتوقفت قياس التألق التدفق، التدفق الخلوي والتصوير خلية واحدة

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

تقنيات لتحليل خارج الخلية الحويصلات عن طريق التدفق الخلوي

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

تطوير وتوصيف<em&gt; في المختبر</em&gt; شبكة Microvessel والقياسات الكمية من غشائي [كا<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; ط</sub&gt; والنيتريك إنتاج أكسيد

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

تقنيات التصوير طليعة الطور والطورية من الانقسام الاختزالي الأول في مجال الاتصالات الأرضية<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; البويضات

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

توصيف تكلس الأحداث عن طريق لايف البصرية والمجهر الإلكتروني تقنيات في Tubeworm البحرية

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...