تلعب الضامة المرتبطة بالورم أدوارًا مهمة في بيئة الورم الدقيقة. فهم كيف الطفرات الجينية المختلفة في الخلايا السرطانية تؤثر على تجنيد الضامة أمر بالغ الأهمية لتصميم العلاج المخصص لمرضى السرطان. هذا المقايسة يوفر وسيلة سهلة وقوية لتقييم التفاعل بين الخلايا السرطانية و الضامة في المختبر.
يمكن تعديل هذا الفحص لتقييم التفاعلات بين الخلايا السرطانية والخلايا المناعية الأخرى في المختبر. لبدء هذا الإجراء، الاحماء المتوسطة الخلايا الجذعية خالية من المصل عن طريق وضعه في حمام مائي في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. رش سطح غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة مع 70٪ الإيثانول ومسح أسفل السطح رش مع المناشف الورقية.
المقبل رش المتوسطة وخلايا مفرزة زجاجات الحل مع 70٪ الإيثانول ومسحها أسفل مع المناشف الورقية. نقل الزجاجات تنظيفها في غطاء غطاء النسيج ثقافة. استرداد خلية الورم ونقلها إلى غطاء غطاء ثقافة الأنسجة.
استلهم الوسط وغسل الخلايا بـ 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. ثم إضافة ملليلترين من حل انفصال الخلية إلى القارورة. تعيين قارورة أسفل في غطاء محرك السيارة، والتحقق من كل دقيقة لمعرفة ما إذا كانت الخلايا السرطانية قد جمعت.
بمجرد أن تُلتف الخلايا السرطانية، انقر بلطف على جانب القارورة لمساعدة الخلايا على الانفصال. بعد هذا، ماصة ثمانية ملليلتر من مصل الخلية الخالية المتوسطة في قارورة وماصة صعودا وهبوطا ثلاث مرات لخلط. نقل هذا التعليق الخلية إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر والطرد المركزي في 200 مرة ز و 4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق.
استلهموا المُنطّع. ثم غسل الخلايا في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني، مع التأكد من ماصة صعودا وهبوطا من ثلاث إلى خمس مرات لخلط. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 200 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق.
استلهمت منا، و resuspend الخلايا في 10 ملليلتر من المتوسطة خالية من المصل. الماصة صعودا وهبوطا من ثلاث إلى خمس مرات لخلط. مزيج 10 ميكرولترات من هذا التعليق الخلية مع 10 ميكرولترات من حل تريبان الأزرق.
الماصات المقبل 10 ميكرولترات من خليط تريبان الأزرق وخلية في شريحة العد، واستخدام عداد خلية التلقائي لتحديد عدد الخلية الحية. استخدم خلية خالية من المصل لضبط كثافة الخلية إلى 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر. ثم بذور مليلترين من الخلايا في كل بئر من لوحة ثقافة ستة بئر.
في الوقت نفسه، إعداد ستة آبار مع ملليلتر اثنين فقط من الخلايا الجذعية خالية من المصل المتوسطة. بعد هذا، احتضان لوحات ستة آبار في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. أول رش سطح غطاء نسيج مع 70٪ الإيثانول ومسح أسفل السطح رش مع المناشف الورقية.
المقبل رش المتوسطة وخلايا مفرزة زجاجات الحل مع 70٪ الإيثانول ومسحها أسفل مع المناشف الورقية. نقل الزجاجات تنظيفها في غطاء غطاء النسيج ثقافة. بعد هذا، استرداد لوحات ستة آبار من الحاضنة.
بعناية ماصة وسائل الإعلام مكيفة في 15 ملليلتر أنابيب أجهزة الطرد المركزي المعقمة، ووضع الأنابيب على الجليد. إضافة 0.5 ملليلتر من حل انفصال الخلايا في كل بئر من لوحات ستة بئر، والتحقق من كل دقيقة إذا كانت الخلايا السرطانية قد جمعت. بمجرد أن تُلتف الخلايا السرطانية، انقر بلطف على جانب اللوحة للمساعدة في فصل الخلايا.
الماص المقبل 2.5 ملليلتر من الخلايا السرطانية صيانة المتوسطة في البئر والماصة صعودا وهبوطا ثلاث مرات لخلط. نقل الخلايا إلى أنبوب جهاز طرد مركزي معقمة 15 ملليلتر. مزيج 10 ميكرولترات من الخلايا مع 10 ميكرولترات من حل الأزرق Trypan، ونقل 10 ميكرولترات من هذا الخليط في الشريحة العد.
استخدام عداد الخلايا التلقائي لتحديد عدد الخلايا الحية، واستخدام المتوسطة خالية من المصل الخلايا الجذعية التي تم احتضانها في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها لضبط حجم وسائل الإعلام مكيفة وفقا لعدد الخلية. تصفية وسائل الاعلام مكيفة من خلال مرشحات ميكرومتر 0.45 ووضع وسائل الاعلام مكيفة على الجليد. للبدء، الاحماء المتوسط IMDM في حمام مائي في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
تنظيف غطاء غطاء الرأس ثقافة الأنسجة مع 70٪ الإيثانول وتنظيف زجاجة من المتوسطة ونقلها إلى غطاء محرك السيارة كما هو موضح سابقا. المقبل نقل قارورة من الخلايا MV-4-11 في غطاء محرك السيارة. Pipette 10 ملليلتر من الخلايا في أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر.
استخدم Trypan Blue وعداد الخلايا التلقائي لتحديد عدد الخلايا الحية كما هو موضح مسبقًا. ثم الطرد المركزي الخلايا في 200 مرة ز وعلى أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. استلهمي الماثرة ويغسل الخلايا بـ 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني.
مرة أخرى في أجهزة الطرد المركزي 200 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. استلهمت من فوق، و resuspend الخلايا في المتوسط IMDM في كثافة الخلية النهائية من مليون خلية لكل ملليلتر. أولا جلب المواد اللازمة إلى درجة حرارة الغرفة.
إضافة 250 ميكرولترات من خلايا MV-4-11 أعدت إلى كل إدراج. أضف التالي 400 ميكرولترات إما متوسطة أو متوسطة مكيفة فقط إلى الغرف السفلية من لوحة 24-well ، مع التأكد من إضافة العينات في ثلاث ية. احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أربع ساعات.
ثم اضغط بلطف إدراج على الجدار الداخلي من نفس البئر وتجاهل إدراج. ماصات بلطف الخلايا في الآبار صعودا وهبوطا ثلاث مرات لخلط. نقل 225 ميكرولترات من هذا التعليق الخلية في آبار لوحة سوداء الجدران 96-جيدا مناسبة لقياس الفلورسنت.
بعد ذلك، تمييع صبغة CyQUANT مع 4x تحلل العازلة بنسبة واحد إلى 75. دوامة لفترة وجيزة وتدور أسفل الحل. نقل 75 ميكرولترات من هذا الحل إلى كل بئر من 96-جيدا لوحة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
باستخدام قارئ لوحة الفلوريسين، اقرأ الفلوريسين وتحليل البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص. في هذه الدراسة، يتم استخدام مقايسة في المختبر لدراسة تفاعل الضامة الورم. وتشير العينات ذات القيم المفلورة العالية إلى أن الوسائط المُكيفة لديها قدرة عالية على توظيف الضامة.
اعتمادا على الحاجة التجريبية، يمكن تضمين ضوابط إضافية. على سبيل المثال، يمكن للمرء استخدام الأجسام المضادة تحييد لعلاج وسائل الإعلام مشروطة لإلغاء chemotaxis الضامة وأداء نفس الطريقة. يمكن للمرء أيضا إضافة chemokines اضافية لوسائل الإعلام مكيفة، والتي هي بمثابة سيطرة إيجابية.
من المهم التحكم في الاختلافات رقم الخلية لهذا الفحص لأن أنواع الخلايا المختلفة يمكن أن تنمو بسرعات مختلفة. في تأكيد الجسم الحي من النتائج في المختبر حاسمة. يمكن للمرء حقن الخلايا السرطانية في الفئران وتحليل الأورام مع تدفق القياسات الخلية, مناعة, وCyTOF لتأكيد النتائج.
