هذا البروتوكول مهم لأن استخدام الأنسجة المجمدة يبسط اللوجيستيات عند تقييم أنسجة متعددة، ويسمح بنقل العينة إلى مختبر بعيد للتحليل، ويمكّن من تأجيل اتخاذ قرار لتحليل الأنسجة لعدة أشهر. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن استخدام النسيج المكعب المجمد لا يتطلب موظفين مدربين على مقايسة المذنب في نخرة، ويقلل من فرصة للأخطاء التقنية وتلف الحمض النووي الميكانيكية التي أدخلت أثناء التلاعب بالعينة. هذه التقنية لديها تطبيق في تطوير الأدوية قبل السريرية، وتقييم سلامة المواد الكيميائية التي تدخل البيئة، والمواد المضافة إلى الأغذية.
ويمكن استخدام الأنسجة المجمدة في مقايسة المذنب لتقييم إمكانات السمية الجينية، وإصلاح الحمض النووي، والآثار الوقائية ضد تلف الحمض النووي الناجم عن العلاج الكيميائي أو الإشعاع، وللرصد الحيوي البيئي. من الناحية المثالية، ينبغي أن تصمم التجارب للسماح بمعالجة كل عينة من الأنسجة إلى خطوة التجميد قبل أن تصبح الأعضاء التي يتم حصادها من الحيوان التالي متاحة للمعالجة. ويمكن رفع دعوى ضد الأنسجة المجمدة في مقايسة المذنب لتقييم إمكانات السمية الجينية، وإصلاح الحمض النووي، والآثار الوقائية ضد تلف الحمض النووي الناجم عن العلاج الكيميائي أو الإشعاع، وللرصد البيولوجي البيئي.
المدربة الفنية كارول بوبيت، ومدير مختبر السموم التحقيقية إيلين جيلاس ستكون بمثابة prosectorctors اليوم. مساعد باحث لينكولن مارتن، وفني الأنسجة أميلي لاديسور سوف تظهر التعامل مع العينة. لبدء هذا الإجراء، إزالة أي تركيب الأنسجة والأعضاء، والحطام من جهاز من مصلحة.
حفيف على الفور الجهاز بقوة في قارب متوسط الحجم يزن يحتوي على ما يقرب من سبعة ملليلتر من محلول مفروم بارد ، أعد طازجة لإزالة الدم المتبقية والحطام. نقل الجهاز إلى آخر نظيفة تزن قارب يحتوي على ما يكفي من محلول مفروم الباردة للحفاظ على الأنسجة المغمورة والحفاظ على الجليد حتى مزيد من المعالجة. للكبد، وقطع مقطع طولي خمسة ملليمتر من الفص الأيسر وحفيف بلطف في حوالي سبعة ملليلتر من محلول مفروم الباردة.
ثم ضع شريط من الأنسجة في قارب نظيف متوسط الحجم يزن يحتوي على ما يقرب من سبعة ملليلترات من محلول مفروم بارد وحافظ على الجليد حتى تصبح جاهزة لمعالجة المزيد. قم بإزالة قسم من الكبد وضعه في شريط التضمين. تنفيذ التثبيت والتشذيب والparffin تضمين وفقا للإجراءات القياسية المختبرية لتقييم علم الأنسجة في المستقبل المحتملة.
لالواثني، وقطع جزء 10 ملليمتر من الاثني عشر قريب إلى المعدة. أدخل إبرة قياس 21 إلى 25 في نهاية واحدة من الاثني عشر وشطف مع ملليلتر واحد من محلول مفروم الباردة لإزالة أي حطام والبكتيريا. الوجه الاثنيع أكثر، ومسح مرة أخرى مع ملليلتر واحد آخر من حل mincing وتجاهل الإبرة.
شريحة الاثنيع فتح وشطفه في حوالي سبعة ملليلتر من محلول المفروم. ثم شطف الاثنيين مرة أخرى والحفاظ عليه في حل المفروم على الجليد حتى تصبح جاهزة لمعالجة أخرى. قص وإصلاح جزء من الاثني العقد المتبقية لتقييم الهستوبات في المستقبل ممكن كما هو موضح سابقا للكبد.
بالنسبة للدماغ، قد يكون من المفيد تقسيم الدماغ أولاً إلى نصفين، مع حفظ نصف الكرة الأرضية واحد لاحتمال علم الأنسجة. تشريح مناطق الدماغ من الفائدة، ثم شطف بلطف لهم، والحفاظ على الجليد في حل المفروم حتى تصبح جاهزة لمعالجة مزيد من، كما هو موضح سابقا للكبد والاثني. المعدة، وإزالة والتخلص من الغابات.
قطع فتح المعدة الغدية، وغسلها خالية من الطعام عن طريق حفيف عليه في قارب وزن متوسط الحجم يحتوي على حوالي سبعة ملليلتر من المخزن المؤقت المفروم الباردة. إزالة شريط خمسة ملليمتر من المعدة غدية قريبة إلى الاثني عشر لتثبيت ممكن تقييم علم الأنسجة كما هو موضح سابقا. ضع المعدة المتبقية في قارب متوسط الحجم يحتوي على ما يقرب من سبعة ملليلترات من المخزن المؤقت المفروم البارد واحتضانه على الجليد لمدة 15 إلى 30 دقيقة.
بعد ذلك، نقل المعدة إلى قطعة نظيفة من البارافين واستخدام شفرة مشرط أو مكشطة الخلايا البلاستيكية لكشط بلطف ظهارة السطح مرتين على الأقل لإزالة الحطام. التقاط الغشاء المخاطي في المعدة مع ملقط واستخدام ماصة لشطفه مع ملليلتر واحد من عازلة مفروم الباردة. نقل أنسجة المعدة المشطفة إلى سطح نظيف أو طبق وإضافة محلول مفروم الباردة.
استخدم الجزء الخلفي من شفرة مشرط أو مكشطة خلايا بلاستيكية لكشط ظهارة المعدة بعناية أربع إلى خمس مرات لإطلاق الخلايا. ثم، استخدام ماصة لجمع محلول مفروم يحتوي على الخلايا المنبعثة، ونقله إلى أنبوب microcentrifuge على الجليد. بالنسبة لعينات الأنسجة المفرومة، قم بقطع قسم من الكبد أو الدماغ أو الاثني والاثني، ونقله إلى أنبوب microcentrifuge المسمى يحتوي على ملليلتر واحد من محلول مفروم بارد.
استخدام مقص المفروم ل mince بسرعة العينة حتى يتم تفريقها في النهاية، مع ضمان أن العينة يبقى الباردة. يجب أن تبدو العينة غائمة قليلاً. ومع ذلك، فمن الشائع لبعض القطع أن تبقى التي سوف تستقر على الجزء السفلي من الأنبوب.
لاستخدام الأنسجة في حين أنها جديدة، والحفاظ على الأنابيب التي تحتوي على عينات على الجليد. لتجميد عينات الأنسجة، قم بتأمين غطاء الأنبوب مباشرة بعد الفرم أو الجمع وإسقاط الأنبوب في قارورة ديوار التي تحتوي على النيتروجين السائل. في ختام حصاد الأنسجة، استخدم مغرفة لاسترداد الأنابيب عينة، ووضعها على الجليد الجاف لفرز.
نقل الأنابيب إلى مربع الفريزر على الجليد الجاف وتخزين مربع في الثلاجة في ناقص 80 درجة مئوية. لإعداد مكعبات من الأنسجة المجمدة، وقطع عدة قطع صغيرة من الأنسجة وإسقاطها بشكل فردي مباشرة في قارب متوسط الحجم أو وعاء مناسب آخر يحتوي على النيتروجين السائل لبضع ثوان. بعد أن تكون القطع قد جمدت تماما، نقل مكعبات الأنسجة المجمدة بشكل فردي إلى أنابيب microcentcente المسمى، أو أنابيب التبريد، على الجليد الجاف.
في ختام حصاد الأنسجة، نقل الأنابيب إلى مربع الفريزر على الجليد الجاف وتخزين مربع في الثلاجة في ناقص 800 درجة مئوية. عند استخدام الأنسجة الطازجة المفروم أو كشط الحفاظ على الجليد الرطب، وإعداد شرائح المذنب في غضون ساعة من الحصاد. عند استخدام الأنسجة المجمدة المفروم أو كشط، ضع أنابيب الأنسجة المجمدة في حمام مائي في درجة حرارة الغرفة حتى تذوب العينات تماما مع ضمان أنها تبقى باردة.
بمجرد إذابة العينات، على الفور نقل الأنابيب على الجليد. بالنسبة للأنسجة المكعيبة، يمكنك استرجاع الأنابيب التي تحتوي على المكعبات من الفريزر والحفاظ على الثلج الجاف حتى إعداد الشريحة. Aliquot ملليلتر واحد من الوسيط التاجر أو حل مفروم في أنبوب microcentuge 1.7 ملليلتر المسمى لكل عينة والحفاظ على الجليد.
العمل بسرعة لتجنب ذوبان الجليد، ووضع مكعب من الأنسجة في الطرف المفتوح من جهاز مفروم الأنسجة درجة حرارة الغرفة. أدخل بسرعة المكبس حقنة حجم مطابقة في الجهاز لدفع الأنسجة في نهاية شبكة، والتي ينبغي بعد ذلك أن توضع في أنبوب microcentrifuge التي تحتوي على محلول مفروم الباردة. غمر نهاية شبكة الجهاز لمدة خمس إلى 10 ثوان تقريبا في محلول مفرم الباردة للسماح للذوبان الأنسجة تماما.
الاكتئاب تماما المكبس حتى ينظر إلى الخلايا البثق من خلال المسام شبكة. ثم سحب المكبس حتى ما يقرب من 2.5 سم واضغط على أسفل مرة أخرى تماما. كرر عدة مرات، حتى يصبح حل مفروم عكر.
لإعداد الشرائح، اخلطي تعليق الخلية بلطف، ونقل 50 ميكرولترات إلى أنبوب يحتوي على 450 ميكرولترات من 0.5٪ نقطة انصهار منخفضة agarose عند 37 درجة مئوية. إعداد الشرائح وتسجيلها كما هو موضح في بروتوكول النص. في الدراسة الأولى، تم حصاد الكبد من اثنين من أفواج الذكور Sprague Dawley الفئران السيطرة على المركبات ترنح من قبل أسبوع واحد.
تم إعداد الشرائح من الأنسجة المفرومة الطازجة ، والأنسجة المفرومة المجمدة ، والأنسجة المكعبة المجمدة. منذ أوصت منظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي الحد الأعلى للحمض النووي الذيل في المئة في الكبد الفئران الطازجة 6٪ هذه النتائج تثبت أن أي من أساليب التجميد يمكن أن تعمل بشكل جيد لتقييم الأنسجة. وعموما، فإن نسبة القنافذ موازية للحمض النووي الذيل في المئة، على الرغم من أن الأنسجة المجمدة أظهرت قدرا أكبر من التباين.
وفي الدراسة الثانية، أُعطيت فئران B6C3F1 مركبة أو غاز الميثان الملتاخن. تشير نتائج الحمض النووي الذيل في المئة إلى أن أنسجة الكبد المجمدة كمكعبات ومعالجتها بعد ذلك باستخدام جهاز مفروم الأنسجة أسفرت عن نتائج مشابهة جدًا لتلك التي تم الحصول عليها للأنسجة المفرومة حديثًا. وقد قيست زيادة ذات دلالة إحصائية في تلف الحمض النووي الناجم عن نظم الإدارة البيئية في عينات الأنسجة التي تمت معالجتها بالأساليب الثلاث.
في الدراسة الثالثة، تم تحليل عينات الكبد التي تم جمعها من الفئران B6C3F1 الإناث في دراسة السمية الكيميائية 90 يوما. كان تلف الحمض النووي في الأنسجة المجمدة المفرومة مرتفعًا عبر جميع مجموعات الجرعة ، مع تقلب حيواني كبير. وترتبط نتائج الحمض النووي الذيل في المئة مع القنافذ في المئة، مما يشير إلى أن القنافذ ساهمت بشكل كبير في ارتفاع مستوى تلف الحمض النووي الذي لوحظ في هذه العينات.
وعلى النقيض من ذلك، كان كل من الحمض النووي التالف والقنافذ في المئة منخفضين جداً في الأنسجة المكعبة المجمدة التي تم إعدادها بالتوازي مع عينات الأنسجة المفرومة. وهكذا، فإن الخلايا شديدة التلف التي تظهر كجرافذ في عينات الأنسجة المفرومة لم تكن نتيجة لعملية بيولوجية، ولكن من المرجح أنها أدخلت عن طريق الاضطرابات الميكانيكية، أو احترار الأنسجة أثناء إجراء الفرم قبل أن يتم تجميد فلاش. ولذلك، اعتبرت البيانات عن الأنسجة المفروم أن تكون غير موثوق بها.
وعلى سبيل المقارنة، تم الحصول على بيانات عالية الجودة من الأنسجة المكعبة المجمدة، حتى بعد التخزين لفترات طويلة. من المهم الحفاظ على الأنسجة المحصودة باردة ورطبة ، والعمل بسرعة لتجميد العينات. أيضا، يجب أن تذوب الأنسجة مكعب المجمدة مباشرة قبل خطوة التجانس.
عينات الأنسجة المجمدة مناسبة لتطبيقات المصب الأخرى، بما في ذلك على سبيل المثال، تعديلات مقايسة المذنب للكشف عن تلف الأكسدة أو الربط المتبادل، وتقييم التغيرات في التعبير الجيني. يجب توخي الحذر أثناء التعامل مع شفرات المشرط لقطع أو كشط الأنسجة ، وعند التعامل مع النيتروجين السائل أثناء عملية التجميد.
