Esse protocolo é significativo porque o uso de tecido congelado simplifica a logística na avaliação de múltiplos tecidos, permite a transferência de amostras para um laboratório remoto para análise, e permite adiar a decisão de analisar um tecido por meses. A principal vantagem desta técnica é que o uso de tecido cubo congelado não requer pessoal treinado no ensaio do cometa na necropsia, e minimiza a oportunidade de erros técnicos e danos mecânicos de DNA introduzidos durante a manipulação da amostra. Esta técnica tem aplicação no desenvolvimento de medicamentos pré-clínicos, a avaliação de segurança de produtos químicos que entram no ambiente e aditivos alimentares.
Tecidos congelados podem ser usados no ensaio do cometa para avaliar o potencial genotóxico, reparação de DNA, efeitos protetores contra danos de DNA induzidos por quimioterapia ou radiação, e para biomonitoramento ambiental. Idealmente, os experimentos devem ser projetados para permitir o processamento de cada amostra de tecido à etapa de congelamento antes que os órgãos colhidos do próximo animal se tornem disponíveis para processamento. Tecidos congelados podem ser processados no ensaio do cometa para avaliar o potencial genotóxico, reparação de DNA, efeitos protetores contra danos de DNA induzidos por quimioterapia ou radiação, e para biomonitoramento ambiental.
A treinadora técnica Carole Bobbitt e a gerente do laboratório de toxicologia investigativa Eileen Gilas estarão servindo como prosetores hoje. O pesquisador Associado Lincoln Martin e a técnica de histologia Amelie Ladesseur estarão demonstrando o manuseio de amostras. Para iniciar este procedimento, remova qualquer tecido, órgãos e detritos de conexão anexados de um órgão de interesse.
Imediatamente swish o órgão vigorosamente em um barco de pesagem de tamanho médio contendo aproximadamente sete mililitros de solução de picar frio e recém-preparado para remover sangue residual e detritos. Transfira o órgão para outro barco de pesagem limpo contendo solução de picar frio suficiente para manter o tecido submerso e mantê-lo no gelo até um processamento adicional. Para o fígado, corte uma seção longitudinal de cinco milímetros do lobo esquerdo e deslize suavemente em cerca de sete mililitros de solução de picar frio.
Em seguida, coloque a tira de tecido em um barco de pesagem de médio porte limpo contendo aproximadamente sete mililitros de solução de picar frio e mantenha no gelo até que esteja pronto para processar ainda mais. Remova uma seção do fígado e coloque-a em um de incorporação. Realizar fixação, aparamento e incorporação de parafina de acordo com os procedimentos padrão laboratorial para possível avaliação histopatologia futura.
Para o duodeno, corte uma porção de 10 milímetros do duodeno proximal ao estômago. Insira uma agulha de calibre 21 a 25 em uma extremidade do duodeno e lave-a com um mililitro de solução de picar frio para remover quaisquer detritos e bactérias. Vire o duodeno, lave-o novamente com outro mililitro de solução de picar e descarte a agulha.
Corte o duodeno aberto e enxágüe-o em cerca de sete mililitros de solução de picar. Em seguida, enxágüe novamente o duodeno e mantenha-o em solução de picar no gelo até que esteja pronto para processar ainda mais. Corte e conserte uma parte do duodeno restante para uma possível avaliação histopatologia futura, como descrito anteriormente para o fígado.
Para o cérebro, pode ser útil primeiro dividir o cérebro em dois hemisférios, com um hemisfério sendo salvo para possível histopatologia. Disseque as regiões cerebrais de interesse, depois enxágue-as suavemente, e mantenha-as no gelo em solução de picar até que estejam prontas para processar ainda mais, como descrito anteriormente para o fígado e duodeno. Para o estômago, remova e descarte oomaca florestal.
Corte o estômago glandular e lave-o livre de alimentos, swishing-lo em um barco de pesagem de tamanho médio contendo cerca de sete mililitros de tampão de picar frio. Remova uma tira de cinco milímetros do estômago glandular proximal ao duodeno para fixação para uma possível avaliação histopatologia, conforme descrito anteriormente. Coloque o estômago restante em um barco de pesagem de tamanho médio contendo aproximadamente sete mililitros de tampão de picar frio e incubar no gelo por 15 a 30 minutos.
Depois disso, transfira o estômago para um pedaço limpo de parafina e use uma lâmina de bisturi ou raspador de células plásticas para raspar suavemente o epitélio superficial pelo menos duas vezes para remover detritos. Pegue a mucosa gástrica com fórceps e use uma pipeta para enxaguar com um mililitro de tampão de picar frio. Transfira o tecido estomacal enxaguado para uma superfície limpa ou prato e adicione solução de picar a frio.
Use a parte de trás de uma lâmina de bisturi ou um raspador de células plásticas para raspar cuidadosamente o epitélio estomacal de quatro a cinco vezes para liberar as células. Em seguida, use uma pipeta para coletar a solução de picar contendo as células liberadas, e transferi-la para um tubo de microcentrifuge no gelo. Para picar amostras de tecido, corte uma seção de fígado, cérebro ou duodeno e transfira-o para um tubo de microcentrifuge rotulado contendo um mililitro de solução de picar frio.
Use uma tesoura para picadinho rápido da amostra até que ela seja finalmente dispersada, garantindo que a amostra permaneça fria. A amostra deve parecer um pouco nublada. No entanto, é comum que algumas peças permaneçam que se acomodem na parte inferior do tubo.
Para usar o tecido enquanto ele estiver fresco, mantenha os tubos contendo as amostras no gelo. Para congelar as amostras de tecido, fixe a tampa do tubo imediatamente após o picar ou coletar e solte o tubo em um frasco de Dewar contendo nitrogênio líquido. Ao final da colheita de tecidos, use uma concha para recuperar os tubos de amostra, e coloque-os em gelo seco para classificar.
Transfira os tubos para uma caixa de congelador em gelo seco e armazene a caixa em um congelador a menos 80 graus Celsius. Para preparar cubos congelados de tecido, corte vários pequenos pedaços de tecido e solte-os individualmente diretamente em um barco de pesagem de tamanho médio ou outro recipiente adequado contendo nitrogênio líquido por alguns segundos. Depois que as peças congelarem completamente, transfira os cubos de tecido congelado individualmente para tubos de microcentrifuuge rotulados, ou tubos crio-tubos, em gelo seco.
Ao término da colheita de tecidos, transfira os tubos para uma caixa de congelador em gelo seco e armazene a caixa em um congelador a menos 800 graus Celsius. Ao usar tecido recém-picado ou raspado mantido em gelo molhado, prepare lâminas de cometa dentro de uma hora após a colheita. Ao usar tecido picado ou raspado congelado, coloque tubos de tecido congelado em um banho de água à temperatura ambiente até que as amostras sejam completamente descongeladas, garantindo que sejam mantidas frias.
Uma vez que as amostras são descongeladas, transfira imediatamente os tubos para o gelo. Para tecido em cubos, recupere os tubos contendo os cubos do congelador e mantenha em gelo seco até a preparação do deslizamento. Alíquota de um mililitro do meio do comerciante ou uma solução de picar em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro rotulado para cada amostra e manter no gelo.
Trabalhando rapidamente para evitar o descongelamento, coloque um cubo de tecido na extremidade aberta de um dispositivo de picar tecido de temperatura ambiente. Insira rapidamente um êmbolo de seringa de tamanho compatível no dispositivo para empurrar o tecido para a extremidade da malha, que deve então ser colocado no tubo de microcentrifuge contendo a solução de picar a frio. Mergulhe a extremidade da malha do dispositivo por aproximadamente cinco a 10 segundos na solução de picar a frio para permitir que o tecido descongele completamente.
Deprimir completamente o êmbolo até que as células sejam vistas extrudendo os poros de malha. Em seguida, puxe o êmbolo para cima aproximadamente 2,5 centímetros e pressione para baixo novamente completamente. Repita várias vezes, até que a solução de picar fique turva.
Para preparar slides, misture uma suspensão celular suavemente e transfira 50 microliters para um tubo contendo 450 microliters de 0,5% de baixo ponto de fusão agarose a 37 graus Celsius. Prepare e marque os slides conforme descrito no protocolo de texto. No primeiro estudo, o fígado foi colhido de duas coortes de ratos machos de controle de veículos Sprague Dawley escalonados em uma semana.
Slides foram preparados a partir de tecido recém-picado, tecido picado congelado e tecido congelado em cubos. Uma vez que a OCDE recomendou o limite superior para o DNA por cento de cauda no fígado de rato fresco é de 6% esses resultados demonstram que qualquer um dos métodos de congelamento pode funcionar bem para avaliar tecidos. No geral, os por cento de ouriços paralelamente ao DNA por cento da cauda, embora os tecidos congelados apresentasse maior variabilidade.
No segundo estudo, foram administrados camundongos B6C3F1 femininos ou o mutagen etísulfonato de metano etílico. Os resultados de DNA por cento da cauda indicam que o tecido hepático congelado como cubos e posteriormente processado usando o dispositivo de picar tecidos produziu resultados muito semelhantes aos obtidos para tecido recém-picado. Um aumento estatisticamente significativo nos danos causados pelo DNA induzido pelo EMS foi medido em amostras de tecido processadas pelos três métodos.
No terceiro estudo, foram analisadas amostras hepáticas coletadas de camundongos B6C3F1 femininos em um estudo de toxicidade química de 90 dias. O dano de DNA no tecido picado congelado foi alto em todos os grupos de dose, com substancial variabilidade animal para animal. Os resultados por cento do DNA da cauda correlacionam-se com por cento de ouriços, indicando que os ouriços contribuíram substancialmente para o alto nível de dano de DNA que foi observado nessas amostras.
Em contraste, tanto o DNA danificado quanto por cento de ouriços eram muito baixos no tecido congelado flash que tinha sido preparado em paralelo com as amostras de tecido picado. Assim, as células altamente danificadas manifestadas como ouriços nas amostras de tecido picado não eram claramente o resultado de um processo biológico, mas provavelmente foram introduzidas por interrupção mecânica, e, ou aquecimento tecidual durante o procedimento de picar antes de serem congelados por flash. Portanto, os dados de tecido picado foram considerados não confiáveis.
Em comparação, os dados de alta qualidade foram obtidos a partir do tecido congelado, mesmo após o armazenamento prolongado. É fundamental manter os tecidos colhidos frios e úmidos, e trabalhar rapidamente para congelar as amostras. Além disso, o tecido cubo congelado deve ser descongelado imediatamente antes da etapa de homogeneização.
Amostras de tecido congelado são adequadas para outras aplicações a jusante, incluindo, por exemplo, modificações do ensaio do cometa para detectar danos oxidativos ou cruzamentos, e avaliação de alterações na expressão genética. Deve-se ter cuidado ao manusear lâminas de bisturi para cortar ou raspar tecidos, e ao manusear nitrogênio líquido durante o processo de congelamento.
