يصف هذا البروتوكول تقنية لاستهداف الأدوية ذات الأهمية لمامامة أسماك الحمار الوحشي اليرقات للتلاعب بوظيفة الضامة وتقييمها. هذه التقنية لديها مزايا على استراتيجيات تسليم الأدوية التقليدية مثل الغمر من خلال ضمان أن يتم استهداف الأدوية على وجه التحديد إلى الضامة من خلال تغليف الليبوسومات. عند تطبيقها على نماذج حمار وحشي من المرض مع عنصر التهابي ، هذه التقنية لديها القدرة على حل كيفية مساهمة الضامة في العمليات المرضية.
هنا ، نبرهن على فائدة هذه التقنية من خلال استهداف دواء مثبط لأنواع الأكسجين المتفاعلة من الميتوكوندريا إلى الضامة لقمع التنشيط. يمكن أن يكون الحقن المجهري للليبوسومات المحملة بالمخدرات إلى يرقات أمرًا صعبًا ، حيث يجب الحرص على عدم التسبب في ضرر ظهاري مفرط ، مما قد يؤثر على الدراسات المناعية. إن العرض التوضيحي المرئي لهذا البروتوكول مهم لأنه يتضمن منهجيات الخلايا الحية الحيوانية الكاملة والصيدلانية الكاملة التي قد لا يتم تنفيذها بشكل روتيني في مختبر واحد.
لإعداد 10 ملليغرام من liposomes في قارورة 25 ملليلتر جولة القاع، إضافة 31 نانوموللار من الأزرق البحري و 300 نانوموللار من المخدرات المثبطة لأنواع الأكسجين الميتوكوندريا التفاعلية إلى القارورة. سونيكات لفترة وجيزة إلى حل كامل، وإزالة المذيب ببطء على المبخر دوارة تعيين على حمام الماء 45 درجة مئوية في 75 التناوب في الدقيقة الواحدة تحت ضغط فراغ. عندما تكون طبقة رقيقة من الدهون الجافة داخل الجدران الزجاجية للقارورة ، قم بتجفيف الفيلم لمدة 45 دقيقة تحت النيتروجين لتسهيل الإزالة الكاملة للمذيبات العضوية.
بعد ذلك ، هيدرات الفيلم مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني ، وختم القارورة مع فيلم البارافين قبل يهيج القارورة باليد على حمام مائي 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد سبع دورات من التجميد والذوبان ، استخدم غشاء البولي كربونات صغير وميكرومتر واحد محفورة لقذف الدهون لمدة دورتين إلى ست دورات. عندما تم الحصول على الحويصلات unilamellar كبيرة، وتكثيف lipوزوes الطازجة في بيليه من قبل الطاردة الفائقة.
احتضان بيليه مع ملليلتر واحد من 1٪ poloxamer 188 حل لمدة 30 دقيقة في 45 درجة مئوية و 750 التناوب في الدقيقة الواحدة في ThermoMixer مع اثنين ملليلتر microcentrifuge أنبوب المرفق. خلال مرحلة ما بعد إدخال poloxamer 188 في lipوزوes، والتركيز البولوكسيموم الصحيح، وقت الحضانة، ودرجة الحرارة مهمة لتحقيق الخصائص الفيزيائية الكيميائية المثلى للليبوسومات الناتجة. في نهاية الحضانة، طرد الخليط فوق المركزية مرة أخرى في ظل نفس شروط الطرد المركزي، وإزالة فوق التي تحتوي على أي البوليمر غير منضم أو المخدرات.
ثم تخزين الكريات ليبوسووم في أربع درجات مئوية، محمية من الضوء. لتحديد حجم و إمكانات زيتا من liposomes، وتمييع تركيبة الدهون مع الماء فائقة الخطورة بنسبة واحد إلى 100. استخدم محلل تشتت ضوئي ديناميكي لقياس حجم الجسيمات ومؤشر تعدد التخصصات وإمكانات زيتا في ثلاث ية عند درجة حرارة 25 درجة مئوية.
لحساب كفاءة الفخ وتحميل المخدرات من lipوزوes، حل lipوزوes في تريتون X-100. حقن 20 ميكرولترات من عينة liposome الذائبة في نظام الكروماتوغرافيا السائلة الضغط العالي مع مضخة رباعية، كاشف صفيف ثنائي مجموعة في 230 نانومتر، وثلاثة ميكرومتر، 250 مرات-4.6 ملليمتر العمود. لإعداد يرقات أسماك الحمار الوحشي المعدلة وراثيا للحقن، استخدم ملقط البقشيش الدقيق لتدبير الأجنة يدويا بعد الإخصاب 30 ساعة، والسماح للأجنة لتطوير في 28.5 درجة مئوية حتى يومين بعد الإخصاب.
عندما تكون الأجنة قد وصلت إلى المرحلة المناسبة ، تمييع تركيبة ليبسوم الطازجة المعدة بنسبة واحد إلى واحد في PBS العقيمة ، وخلط الحل لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان عن طريق الدوامة. صب ما يكفي من السليلوز الميثيل 3٪ في E3 المتوسطة في غطاء صغير، غطاء طبق ثقافة 35 ملليمتر لتشكيل طبقة رقيقة تغطي السطح بأكمله. استخدم ماصة نقل بلاستيكية لجمع بركة من 20 إلى 25 يرقة تخدير تقريبًا.
السماح للأجنة للتركيز على غيض من الماصات عن طريق الجاذبية، ونقل بعناية اليرقات في منتصف غطاء طبق ثقافة 35 ملليمتر مع الحد الأدنى من الحل. استخدام محمل microcapillary لترتيب اليرقات مع اليرقاتteriors نحو الجزء العلوي من لوحة الحقن مع سطح الظهرية التي تواجه نحو إبرة الحقن المجهري للحقن في البطين ندبين أو مع الادراء نحو يسار لوحة الحقن مع الأسطح البطنية التي تواجه نحو إبرة الحقن المجهري للحقن في الأنف الجيب. استخدام محمل microcapillary لتعبئة مرة أخرى إبرة حقن مع ما يقرب من خمسة ميكرولترات من مزيج حقن الدهون.
جبل الإبرة في micromanipulator متصلة موقف مغناطيسي وحاقن الضغط، ووضع الإعداد تحت مجهر ستيريو. استخدام نظيفة، غرامة تلميح ملقط لقطع غيض من إبرة الحقن المجهري لتوليد فتحة من ما يقرب من خمسة ميكرومتر في القطر. تعيين حاقن إلى مدة نبض حوالي 50 مللي ثانية وضغط الحقن من حوالي 40 جنيه لكل بوصة مربعة.
حقن بولوس في قطرة من النفط المعدني المتمركزة على خطوط الشبكة من قياس الهيموسيت لمعايرة حجم ليتم حقنها. ثم ضبط مدة النبض و / أو ضغط الحقن حتى قطر البلينوس يغطي 2 1/2 من أصغر خطوط الشبكة. حقن بعناية نانولتر واحد من مزيج حقن الدهون في البطين هدبرين من كل يرقات.
مباشرة بعد الحقن، إضافة E3 المتوسطة إلى لوحة الحقن، واستخدام ماصة نقل البلاستيك لتهيج بلطف اليرقات من السليلوز الميثيل. لتصوير السطح الظهري للـ hindbrain على مجهر confocal مجهز بعدسة غمر الماء ، قم أولاً بملء طبق ثقافة 35 ملليمترًا إلى عمق خمسة ملليمترات مع وسيط متصاعد ، والسماح للبليمرة المتوسطة. حفر خندق صغير في agarose من مساحة كافية لاستيعاب كيس صفار الجنين التجريبي، واستخدام ماصة نقل البلاستيك مليئة المتوسطة المنصهرة تصاعد لجمع يرقة تخدير.
قم على الفور بإيداع اليرقة في طبق الثقافة ، واستخدم محملًا صغيرًا لتوجيه الجانب البطني التاجي الصفير إلى أسفل إلى الثقوب المحفورة. الحفاظ على الجنين في هذا الموقف حتى يتممرر agarose. تراكب الجنين مع E3 المتوسطة تكمل مع 200 ميكروغرام لكل ملليلتر من tricaine.
ولعيش صورة البطين الخلفي، حدد الهدف 20x، وقم بتعيين المجهر confocal إلى 512 في 512 بكسل و 2.5x التكبير. عندما تم تعيين المعلمات المجهر، والحصول على 40 في ثلاثة ميكرومتر Z-مد مد من سطح الظهر معظم من hindbrain باستخدام التصوير بقناتين لتصوير الدهنية الفلورية الزرقاء و الضامة الفلورية الخضراء. عندما يتم الحصول على كافة الصور، قم بتحميل الملفات في برنامج تحليل الصور ثلاثية الأبعاد المناسب.
ضمن علامة التبويب القياس، اسحب بروتوكول البحث عن الكائنات إلى مساحة السحب المهام هنا لإجراء القياسات. حدد قناة DAPI لتمييز الليبوسومات، واسحب أداة الفحص من خلال المقاطع Z للكشف عن الضامة المحملة بالزبس. لقياس كثافة الفلوريسنس من liposomes داخل الخلايا الفردية، اسحب مقطع إلى المناطق ذات الأهمية البروتوكول إلى مهام السحب هنا لجعل القياسات الفضاء، واستخدام أداة المستطيل لرسم مربع حول الخلية من الاهتمام في الأبعاد س، ص، و Z.
ثم حدد جعل عنصر القياس من القائمة المنسدلة القياسات لإنشاء ملف قياس في نافذة المكتبة. في هذا الجدول، يتم تلخيص حجم، زيتا المحتملة، تحميل المخدرات، وكفاءة الفخ من liposomes المنتجة. كما لوحظ، حجم الجسيمات من liposomes مماثلة مع وبدون تحميل المخدرات، على الرغم من أن تهمة سطح liposomes محملة بالمخدرات قليلا أكثر حيادا من liposomes السيطرة مع الأزرق البحري فقط.
الحقن المجهري للليبوسومات البحرية ذات العلامات الزرقاء في البطين الخلفي ، كما هو موضح ، يؤدي إلى امتصاص سريع من قبل الضامة المقيمة التي يمكن تحديدها بسهولة عن طريق المجهر confocal بواسطة ثلاث ساعات بعد الحقن. ومع ذلك، نادراً ما تلاحظ العدلات لاحتواء ليبوسومات داخل الخلايا. داخل الضامة الفردية المحملة بالليبوسومات ، تتراكم الليبوسومات داخل مقصورات الفومرسيوم ، وهو أمر ضروري لتحلل الليبوسومات ومحتوى المخدرات اللاحقة في السيتوبلازم.
يمكن التسليم في الجيوب الأنفية venosus تسليم الدهون إلى الضامة الأنسجة ال دموي السدية المقيم عبر الدورة الدموية. يمكن للدمج المجهري للليبوسومات الدهنية المحملة بالمخدرات المثبطة لأنواع الأكسجين التفاعلية الميتوكوندريا في البطين الخلفي أن يقمع بشكل كبير أحادي الصوديوم urate الذي يحركه الكريستال يحركها إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية الميتوكوندريا داخل الضامة الهندية المقيمة في الليبوسومات. مزيد من التحقق من الآثار القمعية للأدوية ذات الأهمية على الدول تنشيط الضامة يمكن أن يؤديها عن طريق التحقيق في التعبير الجيني cytokine proinflammatory من قبل جبل كامل في التهجين الموقعي والتجنيد الزمني من العدلات.
باستخدام هذه التقنية ، تمكنا من استهداف الأدوية للضامة للتأكد من أن آلية استقلاب المناعة تدفع تنشيطها في نموذج حمار وحشي يرقات من التهاب النقرس الحاد. ويمكن أن تشمل عمليات التكيف المستقبلية لهذا البروتوكول إجراء تعديل سطحي للليبوسومات لتعزيز استهداف الضامة أو لتعزيز الاستهداف للخلايا المناعية الأخرى، مثل العدلات.
