وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية منحة R01AI079253 (لBHS)، والمعهد الوطني للسرطان مركز سرطان دعم المنح CA016056 لمعهد روزويل بارك للسرطان.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي أجريت على الحيوانات في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام في معهد روزويل بارك للسرطان وامتثلت لجميع الدولة الاتحادية، والمعاهد الوطنية للصحة اللوائح. 1. في الجسم الحي بلعم صفها ملاحظة: PHK26 هو صبغ محبة للدهون التي سيتم تناولها من قبل الخلايا البلعمية في كل من الدورة الدموية والأنسجة في عندما تدار عن طريق الوريد (رابعا). وقد استخدم PKH26 لوضع العلامات في الجسم الحي لتقليل كمية من التلاعب ما بعد الحصاد من البلاعم. PKH-26 في الاستفادة من تراكم ثابت في الضامة السنخية على مدى فترات طويلة. الانتظار بعد 10 أيام الإدارة يسمح لتطهير جميع الخلايا المسمى من التداول البلاعم السنخية ولم يتبق سوى المسمى ثابت مع PKH26 8، 9. PKH26 هو تألقي الحمراء التي لديها الإثارة (551 نانومتر) والانبعاثات (567 نانومتر) الخصائص المتوافقةمع أنظمة رودامين أو الكشف فيكوإيريترين. يمكن لأي إجراءات وضع العلامات إدخال قطعة أثرية، بما في ذلك فقدان قدرتها على البقاء. ومع ذلك، وبما أننا نستخدم نفس النهج لوضع العلامات الضامة في المورثات الماوس مختلفة (على سبيل المثال، WT-أوكسيديز NADPH مقابل ناقص)، وآثار هذه الأعمال الفنية أن تكون موحدة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الحل الأسهم من PKH26 (1 × 10 -3 M في الإيثانول) في 01:05 مخفف C المقدمة من قبل الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 100 ميكرولتر من المخفف PKH26 إلى الأنسولين حقنة 1/2 مل (29 G × 1/2 &quot;) لكل الماوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدارة على الفئران عن طريق الحقن الرابع (إما الذيل الوريد أو الرجعية المدارية) 10 يوما على الأقل قبل الحصاد. </li></ol> 2. حصاد الضامة السنخية بواسطة القصبات الغسل (BAL) يمكن أن تختلف في عدد من الفئران لاستخدامها في تجربة. A العائد نموذجية من الماوس unstimulated هو في حدود 3-5 × 10 5 الضامة السنخية، ولكن هذا العدد يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا النحتإد على عوامل مثل حجم الفأر، خبرة الشخص أداء غسيل، وعدد instillations من السائل غسل وحجم سحبها من الرئتين. في هذا البروتوكول يتم تنفيذ غسيل الرئة مع تجويف الصدري المغلقة التي جنبا إلى جنب مع تكرار 1 مل lavages يساعد على زيادة الغلة الخلية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس عن طريق إدارة جرعة قاتلة من مخدر AVERTIN (12.5 ملغ) الغشاء البريتونى (IP) باستخدام ظروف معقمة للحفاظ على محلول معقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رذاذ الماوس تماما مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الجلد من نهاية الجمجمة من الحيوان تعريض الصدر (الشكل 1A). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل قطع صغير في الجلد فقط تحت الحجاب الحاجز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج إصبع في خفض وسحب الجلد بعيدا عن نهاية الجمجمة من (1A الشكل) الحيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دفع ما يصل قليلا على الرأس، وتمتد الجانب البطني من الرقبة (الشكل 1A). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع ثقب صغير من خلال القفص الصدريفي الجانب الأيمن من الصدر لامتصاص التضخم الرئتين وأيضا يسمح التصور من الرئتين خلال الخطوات التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد موقع القصبة الهوائية، وبعناية تشريح الأنسجة المحيطة بها بعيدا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الغدد اللعابية والعضلات العضلة القصية والحنجرة، وما إلى ذلك مع ملقط المنحني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع بعناية مع ملقط المنحني وقطع مع مقص النسيج الرقيق الذي يغطي القصبة الهوائية (البرانية) الكشف عن بنية الغضروف الحلقية الأساسية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج قسطرة في القصبة الهوائية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط المنحني، ووضع خياطة وراء (الظهرية ل) القصبة الهوائية وسحب بطول 10 سم من خلال فتح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدءا فوق الحلقي (حلقة سميكة من غضروف) توجيه بعناية 22 G قسطرة أسفل القصبة الهوائية وقف حيث يختفي القصبة الهوائية وراء القص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بحزم التعادل خياطة حول القصبة الهوائية والقسطرة لنوبة دافئ. إزالة الإبرة من القسطرة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع 4 في اتجاه محبس. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شغلواحد 6 مل المحاقن مع DPBS، 1٪ FBS ونعلق على 4 في اتجاه محبس كما هو مبين في الشكل 1B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق فارغة 6 مل حقنة في موقف مبين على 4 في اتجاه محبس (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق منفذ مفتوح على 4 في اتجاه محبس لقسطرة (الشكل 1B). نكون حذرين حتى لا طرد القسطرة من القصبة الهوائية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع السائل غسل من الرئتين. ملاحظة: المحققون قد تختار لاستخدام وحدات التخزين أقل من السوائل غسيل لتقليل احتمال حدوث تلف في الأنسجة. من المهم أن نفس النهج يتم تطبيقها باستمرار في جميع الفئات الماوس. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل مقبض على محبس حتى يتم إغلاق حقنة فارغة وحقن ببطء ~ 1 مل DPBS، 1٪ FBS لتضخيم الرئتين. مراقبة التضخم الرئة من خلال قطع حفرة في الخطوة 2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب الحرص على عدم overinflate الرئتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل مقبض على محبس بحيث يتم إغلاق حقنة كاملة، وسحب بعناية الانفلونزا<html> معرف من الرئتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة الرئتين فرغ من خلال قطع حفرة في الخطوة 1.4. قد تحتاج القسطرة أن تحرك حركة طفيفة في الظهر أو إيابا للحصول على قرعة جيدة. اتخاذ الاحتياطات الخاصة للحفاظ على القسطرة داخل القصبة الهوائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2.8.1-2.8.4 5-6X حتى كل DPBS، 1٪ تم حقن FBS وسحبها من الرئتين. ملاحظة: سوف استرداد السوائل الرئة لا تكون 100٪ من سائل المحقون. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقنة فارغة بسائل غسيل في أنبوب مخروطي 50 مل. إبقاء الخلايا في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتصب قبالة طاف. يمكن حفظ هذا لتحليل خلوى اذا شئت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا resuspend في 1-5 مل 1640 RPMI مع FBS 10٪ والاعتماد على عدادة الكريات. في الماوس unstimulated، ومن المتوقع أن تكون الضامة، والتي يمكن التأكد من الخلايا&gt; 95٪ من الخلايا تحصد BAL. </li></ol> 3. التثقيف وحصاد الفطر &quot;&gt; وفوميجاتوس الرشاشيات المستخدمة في هذا البروتوكول عن GFP في جميع مراحل دورة حياتها: جراثيم، germlings وخيوط وقدمت هذه السلالة الفطرية الدكتور مارجو مور، جامعة سايمون فريزر، برنابي، BC، كندا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة غبيرات من سلالة الرشاشيات الدخناء معربا عن GFP في سابورو القلب ضخ الدماغ (بهي) أجار الميول مع كلورامفينيكول (0.05 ز / L) وجنتاميسين (0.5 جم / لتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في الظلام توج فضفاضة لمدة 7 إلى 10 أيام في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصاد غبيرات عن طريق الغسيل الميل مع 10 مل من 0.01٪ توين 20 في DPBS. بخفة كشط الفطر مع stripette لتخفيف. شطف مائل عدة مرات لزيادة الغلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير تعليق غبيري من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرومتر إلى 50 مل المخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه غبيرات بواسطة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غبيرات resuspend في 50 مل DPBS والعد باستخدام عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مرتين مع DPBS وتمييع لتركيزات المطلوبالفلترة. </li></ol> 4. التحدي الفطرية ومتحد البؤر المجهري للتحقيق في دور بلعم NADPH أوكسيديز في الدفاع المضيف، تم تقييم قدرة الضامة السنخية الفئران المعزولة من ثلاثة أنماط جينية للسيطرة على نمو الجراثيم المبتلعة الرشاشيات. وتشمل الطرز الوراثية المستخدمة في هذه الدراسة؛ 1) من النوع البري الفئران، 2) Ncf1 * / * المنغنيز والفئران مع طفرة Ncf1 طبيعيا (Ncf1 بترميز لphox P47، مكون مطلوب من أوكسيديز NADPH بلعمية) تركهم NADPH أوكسيديز ناقصة، و3) Ncf1 * / * المنغنيز + الفئران المعدلة وراثيا (MN يدل على التحوير ايواء wildtype Ncf1 تحت سيطرة المروج CD68 الإنسان) حيث تم إعادة تشكيل NADPH أوكسيديز النشاط في عدد السكان الوحيدات / بلعم 10، 11. هو الانسب المجهري متحد البؤر لهذا الفحص نظرا لوجودونمو غبيرات غير المبتلعة على الشرائح. سوف المجهر متحد البؤر تسمح لرؤية الطائرات الفردية ضمن Z-المحور، وتمكين التفريق بين الفطريات المتنامية في جميع أنحاء بدلا من داخل البلاعم. يتم الحصول على جميع الصور متحد البؤر باستخدام عدسة 63X الغمر النفط. يتم الحصول على Z-مداخن مع عامل التكبير الإلكترونية من 2.5. يتم تحديد سمك Z-مكدس باستخدام دابي والصور مجال مشرق لتحديد أعلى وأسفل الحقل. تراوحت Z-مداخن 14-24 ميكرومتر مع شرائح الفردية ~ 1 ميكرون سميكة. لتقدير حجم الضامة، وأجريت عمليات الفحص واحدة من التكبير الإلكترونية 1X على 10 حقول في التركيب الوراثي. وحددت الضامة سليمة على أساس PKH26 وتلطيخ دابي من الغشاء والنواة على التوالي. وقد تم تحديد غبيرات على أساس التعبير FITC وصورة حقل مشرق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد coverslips العقيمة وألواح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، ونقع 22 × 22 مم coverslips الزجاج في 70٪ ethanoلتر لمدة 5-10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف coverslips في برنامج تلفزيوني العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط معقم، ووضع بلطف ساترة واحد في الجزء السفلي من كل بئر من العقيمة معبأة منفردة وحة 6 جيدا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور ~ 1 × 10 6 تحصد المسمى PKH26 الضامة السنخية علقت في 300 ميكرولتر RPMI 1640، 10٪ FBS على كل ساترة. قد تختلف العدد الدقيق اعتمادا على محصول الحصاد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح بلعم على الالتزام التي يحتضنها عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2 بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح اليوم التالي، إضافة ~ 1 × 10 7، معربا عن GFP A. فوميجاتوس غبيرات علقت في 100 ميكرولتر قبل حرارة (37 درجة مئوية) RPMI 1640، 10٪ FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة إلى لوحة الحاضنة 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي أن تكون ثابتة الخلايا مدة لا تقل عن 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. في 3 و 7 و 14 ساعة خلايا الإصلاح عن طريق إضافة حجم مساو من 2٪ الفورمالديهايد إلى كل بئر (تركيز النهائي 1٪ الفورمالديهايد). مكان لوحات لنقاط زمنية مبكرة في 4 درجات مئوية خلال الليل. لنقطة مرة الأخيرة (14 ساعة)، وإصلاح الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التثبيت، وإزالة بلطف coverslips باستخدام ملقط وشطف في DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة السوائل الزائدة عن طريق وضع حافة ساترة على Kimwipe مطوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6 تطبيق ميكرولتر مضان المتوسطة المتزايدة مع دابي إلى شريحة المجهر والزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حافة واحدة من ساترة على الشريحة وإسقاط بلطف مع الجانب الخلية أسفل إلى المتوسطة المتزايدة. وتصاعد المتوسطة تنتشر وتشكل حتى طبقة تحت ساترة. ليست هناك حاجة للضغط على ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر واضحة وتسمح للهواء الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخزن أعد الشرائح في مربع الشريحة (محمية من الضوء) في درجة حرارة الغرفة حتى جاهزة للتحليل بواسطة المجهر متحد البؤر. </li></ol>

<ol>
	<li>Reeves, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+activity+of+neutrophils+is+mediated+through+activation+of+proteases+by+K++flux.">Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux.</a> Nature. 416, 291-297 (2002).</li><li>Bianchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+NET+formation+by+gene+therapy+in+CGD+controls+aspergillosis.">Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis.</a> Blood. 114, 2619-2622 (2009).</li><li>Vethanayagam, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+NADPH+oxidase+versus+neutrophil+proteases+in+antimicrobial+host+defense.">Role of NADPH oxidase versus neutrophil proteases in antimicrobial host defense.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Grimm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-+and+Macrophage-Targeted+NADPH+Oxidase+Mediates+Antifungal+Host+Defense+and+Regulation+of+Acute+Inflammation+in+Mice.">Monocyte- and Macrophage-Targeted NADPH Oxidase Mediates Antifungal Host Defense and Regulation of Acute Inflammation in Mice.</a> The Journal of Immunology. 190, 4175-4184 (2013).</li><li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+protection+against+conidia+by+mononuclear+and+against+mycelia+by+polymorphonuclear+phagocytes+in+resistance+to+Aspergillus.+Observations+on+these+two+lines+of+defense+in+vivo+and+in+vitro+with+human+and+mouse+phagocytes.">Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes.</a> J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).</li><li>Philippe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+of+Aspergillus+fumigatus+by+alveolar+macrophages+is+mediated+by+reactive+oxidant+intermediates.">Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates.</a> Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).</li><li>Cornish, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+nicotinamide+adenine+dinucleotide+phosphate+oxidase-independent+resistance+to+Aspergillus+fumigatus+in+alveolar+macrophages.">Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-independent resistance to Aspergillus fumigatus in alveolar macrophages.</a> J Immunol. 180, 6854-6867 (2008).</li><li>Jennings, J. H., Linderman, D. J., Hu, B., Sonstein, J., Curtis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+recruited+to+the+lungs+of+mice+during+immune+inflammation+ingest+apoptotic+cells+poorly.">Monocytes recruited to the lungs of mice during immune inflammation ingest apoptotic cells poorly.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 108-117 (2005).</li><li>Davidson, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DISCRIMINATION+OF+RESIDENT+AND+INFILTRATED+ALVEOLAR+MACROPHAGES+BY+FLOW+CYTOMETRY+IN+INFLUENZA+A+VIRUS-INFECTED+MICE.">DISCRIMINATION OF RESIDENT AND INFILTRATED ALVEOLAR MACROPHAGES BY FLOW CYTOMETRY IN INFLUENZA A VIRUS-INFECTED MICE.</a> Experimental Lung Research. 31, 323-339 (2005).</li><li>Gelderman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+suppress+T+cell+responses+and+arthritis+development+in+mice+by+producing+reactive+oxygen+species.">Macrophages suppress T cell responses and arthritis development in mice by producing reactive oxygen species.</a> J Clin Invest. 117, 3020-3028 (2007).</li><li>Pizzolla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+produced+by+the+NADPH+oxidase+2+complex+in+monocytes+protect+mice+from+bacterial+infections.">Reactive oxygen species produced by the NADPH oxidase 2 complex in monocytes protect mice from bacterial infections.</a> J Immunol. 188, 5003-5011 (2012).</li><li>Luther, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+phagocytic+uptake+of+Aspergillus+fumigatus+conidia+by+macrophages.">Characterisation of the phagocytic uptake of Aspergillus fumigatus conidia by macrophages.</a> Microbes and Infection. 10, 175-184 (2008).</li><li>Geunes-Boyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+Protein+D+Increases+Phagocytosis+of+Hypocapsular+Cryptococcus+neoformans+by+Murine+Macrophages+and+Enhances+Fungal+Survival.">Surfactant Protein D Increases Phagocytosis of Hypocapsular Cryptococcus neoformans by Murine Macrophages and Enhances Fungal Survival.</a> Infection and Immunity. 77, 2783-2794 (2009).</li><li>Garc&#237;a-Rodas, R., Gonz&#225;lez-Camacho, F., Rodr&#237;guez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Zaragoza, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Interaction+between+Candida+krusei+and+Murine+Macrophages+Results+in+Multiple+Outcomes,+Including+Intracellular+Survival+and+Escape+from+Killing.">The Interaction between Candida krusei and Murine Macrophages Results in Multiple Outcomes, Including Intracellular Survival and Escape from Killing.</a> Infection and Immunity. 79, 2136-2144 (2011).</li><li>Ryan, L. K., Vermeulen, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+from+C3H/HeJ+mice+show+sensitivity+to+endotoxin.">Alveolar macrophages from C3H/HeJ mice show sensitivity to endotoxin.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 12, 540-546 (1995).</li><li>Redente, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+polarization+of+alveolar+macrophages+and+bone+marrow-derived+monocytes+following+chemically+and+pathogen-induced+chronic+lung+inflammation.">Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation.</a> J Leukoc Biol. 88, 159-168 (2010).</li><li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. I., Davis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+of+Aspergillus+spores+depends+on+the+anatomical+source+of+the+macrophage.">Killing of Aspergillus spores depends on the anatomical source of the macrophage.</a> Infect Immun. 42, 1109-1115 (1983).</li><li>Goodridge, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+use+of+CARD9+by+dectin-1+in+macrophages+and+dendritic+cells.">Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells.</a> J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

استخدام هذا النهج لالسابقين فيفو تحليل نشاط مضاد الضامة في الجسم الحي جنبا إلى جنب مع الفطرية التحدي، أثبتنا سابقا أن أوكسيديز NADPH في الضامة تلعب دورا هاما في الدفاع ضد A. فوميجاتوس 4. استخدام الضامة السنخية معزولة يتيح لنا التركيز على نشاطهم مضاد ...

الضامة السنخية هي الخلايا البلعمية الخط الأول التي تواجه الميكروبات المستنشق. الضامة الاعتراف الزخارف الرشاشيات بواسطة مستقبلات الاعتراف الممرض، واستيعاب الحد من نمو الجراثيم استنشاقه (غبيرات)، والشروع في الاستجابات الالتهابية. أوكسيديز NADPH بلعمية يحول الأكسجين الجزيئي لأنيون الفائق والمصب سيطة الاكسجين التفاعلية (رويس). الداء الحبيبي المزمن (CGD) هو اضطراب وراثي من أوكسيديز NADPH تتميز الالتهابات البكتيرية والفطرية الشديدة والاستجابات الالتهابية المفرطة. على الرغم من NADPH أوكسيديز هو أمر حاسم لبوساطة العدلات دفاع المضيف 1-3، ليست محددة جيدا أهمية NADPH أوكسيديز في الضامة. وقد أظهرت دراسات سابقة أن الضامة السنخية استيعاب وقتل الجراثيم الرشاشيات، في حين تستهدف أساسا العدلات المرحلة خوطي 5. ومع ذلك، فقد كان هناك تضارب بالنتيجهنهاية الخبر لدور أوكسيديز NADPH في البلاعم في السيطرة على نمو A. فوميجاتوس جراثيم 6، 7. وكان الهدف من هذا الأسلوب لتحديد دور محدد من NADPH أوكسيديز في الضامة في التوسط الدفاع المضيف ضد A. جراثيم فوميجاتوس. وجدنا أن أوكسيديز NADPH في الضامة السنخية تسيطر على نمو المبتلعة A. فوميجاتوس جراثيم 4. لنمذجة الأكثر تطابقا استجابة المضيف لاستنشاق الفطريات، استخدمنا الضامة السنخية المقطوع من قبل غسل الشعبى من الفئران unstimulated التالية التضحية فورا. استخدام الضامة السنخية معزولة مكنتنا من التركيز على نشاطهم مضاد للفطريات في غياب الخلايا المناعية الأخرى (على سبيل المثال، العدلات المعينين) التي تدافع ضد الرشاشيات في الجسم الحي. في هذه الطريقة، كانت ملطخة الضامة السنخية في الجسم الحي قبل الحصاد وذلك لتقليل كمية من التلاعب في مرحلة ما بعد الحصاد. &lt;/ ع&gt; ميزة أخرى لهذا البروتوكول هو استخدام، معربا عن GFP A. فوميجاتوس السلالة. هذه الفطريات عن GFP من مرحلة غبيري خلال المرحلة خوطي وليس لديها الحاجة إلى مزيد من تلطيخ. للحصول على صور مع بمزيد من التفصيل، اخترنا المجهري متحد البؤر والتي تمكن إعادة بناء هياكل ثلاثية الأبعاد من الصور التي تم الحصول عليها. إعادة البناء ثلاثي الأبعاد يعطي القدرة على التفريق بين خيوط متنامية في جميع أنحاء بدلا من أو من خلال البلاعم. غبيرات يمكن أيضا أن تكون متميزة تماما كما داخل الخلايا مقابل خارج الخلية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">PKH26GL-1KT</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2,2,2 Tribromoethanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T48402</td>
			<td>Used to make AvertinAnesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-methyl-2-butanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A-1685</td>
			<td>Used to make AvertinAnesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">NH4CL</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A0171</td>
			<td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">KHCO3</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P91444</td>
			<td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6758</td>
			<td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">22 gauge X 1.00 inch i.v. catheter</td>
			<td style="width:71px;">BD&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">381523</td>
			<td>Insyte Autoguard Winged</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">insulin syringes</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6 ml syringes</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">4-way stopcock</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-700-077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">suture thread</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 ml conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">gauze sponges (4 inch square)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI 1640 with L-glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30396.03</td>
			<td>heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hema 3 Stain Set</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-122-911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cytoseal 60</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants</td>
			<td style="width:71px;">BD&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">297252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100 micron Cell Strainers</td>
			<td style="width:71px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">64753-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">scissors</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">forceps</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biological Safety Cabinet Class II</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leica DM1000 light microscope</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cytospin 2 centrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Cell Culture Incubator</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>37 &#176;C, 5%&#160; CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">22X22 mm micro cover glass</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48366-227</td>
			<td>glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6 well Cell Culture Plates</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH0502-1LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vectashield Mounting medium with DAPI</td>
			<td style="width:71px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leica TCS SP2 system with a laser point scanner</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing anti-fungal activity of isolated alveolar macrophages by confocal microscopy

الرئة هو واجهة حيث تتعرض الخلايا المضيفة بشكل روتيني للميكروبات والمنتجات الميكروبية. الضامة السنخية هي الخلايا البلعمية الخط الأول التي تواجه الفطريات والميكروبات الأخرى المستنشق. الضامة والخلايا المناعية الأخرى تعترف الزخارف الرشاشيات بواسطة مستقبلات الاعتراف الممرض والشروع في الاستجابات الالتهابية المصب. أوكسيديز NADPH بلعمية يولد سيطة الاكسجين التفاعلية (رويس) وهذا أمر مهم للدفاع المضيف. على الرغم من NADPH أوكسيديز هو أمر حاسم لبوساطة العدلات دفاع المضيف 1-3، ليست محددة جيدا أهمية NADPH أوكسيديز في الضامة. وكان الهدف من هذه الدراسة لتحديد دور محدد من NADPH أوكسيديز في الضامة في التوسط الدفاع المضيف ضد A. فوميجاتوس. وجدنا أن أوكسيديز NADPH في الضامة السنخية تسيطر على نمو المبتلعة A. فوميجاتوس جراثيم 4. هنا، نحن تصف طريقة لتقييم قدرة الفأرالضامة lveolar (AMS) للسيطرة على نمو الجراثيم المبتلعة الرشاشيات (غبيرات). هي ملطخة الضامة السنخية في الجسم الحي وعزل بعد عشرة أيام من الفئران عن طريق غسل القصبات (BAL). ومطلي الضامة على coverslips الزجاج، ثم المصنف مع بروتين الفلورية الخضراء (GFP)، معربا عن A. جراثيم فوميجاتوس. في أوقات محددة، يتم إصلاح الخلايا ويتم تقييم عدد الضامة سليمة مع الجراثيم المبتلعة بواسطة المجهر متحد البؤر.

<html> وجمع البلاعم السنخية بواسطة BAL من الفئران unstimulated يؤدي إلى السكان نقية&gt; 95٪ على أساس علم الخلايا. 3 و 7 ساعة (الشكل 2) نقاط زمنية تسبق مرحلة خوطي من نمو الفطريات والسماح للمقارنة بين كفاءة أكلة من غبيرات بين الأنماط الجينية. نقطة الساعة 14 ساعة حيث يمكن مقارنة ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy at JoVE.com

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

وهناك طريقة لتقييم قدرة معزولة الضامة السنخية الماوس للسيطرة على نمو الجراثيم المبتلعة من قبل الرشاشيات المجهري متحد البؤر.

تقييم نشاط مضاد للفطريات المعزولة من السنخية الضامة التي كتبها متحد البؤر المجهري

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

assessing-anti-fungal-activity-isolated-alveolar-macrophages-confocal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K Views.  Roswell Park Cancer Institute.  وهناك طريقة لتقييم قدرة معزولة الضامة السنخية الماوس للسيطرة على نمو الجراثيم المبتلعة من قبل الرشاشيات المجهري متحد البؤر. 

Video: Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Intravital الميكروسكوب في الطحال : التحليل الكمي للتنقل الطفيلي وتدفق الدم

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

التصوير في الوقت الحقيقي من خلايا الدم النخاعي في ديناميات<em&gt; APC<sup&gt; مين / +</sup</em&gt; الأورام المعوية التي كتبها غزل القرص متحد البؤر المجهر

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

ترنسفكأيشن كفاءة عالية من الإنسان THP-1 الضامة بواسطة Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

البروتين من التنميط الضامة التي كتبها 2D الكهربائي

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

جيل وتحديد GM-CSF المشتقة مثل السنخية الضامة والخلايا الجذعية من الفأر نخاع العظم

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

التوصيف المظهري لالضامة من الكلى الجرذ بواسطة التدفق الخلوي

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.

عزل وتوصيف وتنقية الضامة من الأنسجة المتضررة من التهاب المتصلة بالسمنة

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

تصور بلعم الفخاخ خارج الخلية باستخدام المجهر [كنفوكل]

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

الوقت الفاصل بين التصوير 3D البلعمه التي الضامة الماوس

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...