لقد طورنا طريقة تصاعد لتصوير الوقت الفاصل الذي يسمح للنمو غير المقيد لأجنة حمار وحشي هشة وفي الوقت نفسه يبقيها في وضع ثابت تماما. هذه الطريقة تصاعد سريع وسهل ورخيص ويعمل على التصوير المختبري على أي مجهر مقلوب. لقد طورنا هذه الطريقة لتصوير أجنة الحمار الوحشي الحية ، ولكن يمكن تعديلها لتصوير نماذج الحيوانات المائية المائية الصغيرة الأخرى.
ابدأ بتربية الحمار الوحشي البالغ. في فترة ما بعد الظهر، ضع الأسماك في خزانات التربية بنسبة الذكور إلى الإناث من واحد إلى اثنين. ثم إعداد محلول الأسهم من 1٪ تذوب منخفضة agarose في وسائل الإعلام الجنين وتذوب عن طريق تسخينه في فرن الميكروويف.
Aliquot حل agarose في أنابيب 1.5 ملليلتر. جعل حل الأسهم من 4٪ tricaine في الماء المقطر وتخزين agarose والتريكايين في أربع درجات مئوية. Tricaine هو سام ويجب أن يكون وزنه وأعدت في غطاء الدخان.
بعد التزاوج، حصاد أجنة الحمار الوحشي في E3 في طبق بيتري واحتضان لهم في 26.5 درجة مئوية لحوالي 28 ساعة قبل تصاعد. تخدير الأجنة مع 0.02٪ tricaine وdehorionate لهم تحت المجهر عن طريق تجتاح بلطف وسحب chorion بعيدا لاطلاق سراح الجنين. قبل التركيب فقط، قم بتسخين محلول agarose إلى 65 درجة مئوية ثم اتركه يبرد إلى ما يقرب من 30 درجة مئوية حتى لا يتضرر الجنين من الحرارة ويضيف ثلاثية الأجاجين إلى محلول أغاروز.
استخدام 35 ملليمتر الأطباق أسفل الزجاج مع عدد صفر غلاف زجاجي القاع. ضع بلطف جنينًا مُغَفّلًا مع أحد جوانبه الجانبية تجاه الجزء السفلي من الطبق مع ماصة زجاجية أو ميكروبيبيت ، ثم قم بإزالة أي E3 متبقية بعناية باستخدام ميكروبيبيت. أضف أول حل agarose إلى البئر الصغير الذي تم إنشاؤه بواسطة الغطاء الزجاجي المرفق بأسفل الطبق لتغطية الجنين للتأكد من أن الأغاروز يغطي البئر الصغير ولكنه لا يفيض عليه.
غطي البئر الصغير بغطاء زجاجي لإنشاء مساحة ضيقة مليئة بالأغاروز مع الجنين بين نظارتي الغطاء. وضع طبقة من 1٪ agarose حل على رأس الغطاء في جميع أنحاء الجزء السفلي من الطبق الذي سوف تبقي الغطاء في مكان كما أنه يقوي. ثم تعبئة الجزء المتبقي من الطبق مع E3 التي تحتوي على 0.02٪ tricaine للحفاظ على النظام رطب.
لتحديد التركيز الأمثل للأغاروز للطبقة الأولى، قم بتركيب الأجنة في تركيزات متزايدة من الأاروز وقم بتصوير الفاصل الزمني لتحديد التركيز الذي يقلل من تشويه الجنين وحركته، ثم اختبر مجموعة أدق من التركيزات استنادًا إلى النتائج. الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو تحديد التركيز الأمثل من agarose للطبقة الأولى. اختبار تركيزات نانو مختلفة من agarose مثل 0.030٪0.032٪الخ.
لإيجاد التركيز الأمثل. لإجراء التصوير الفاصل الزمني للأجنة، استخدم مرحلة المجهر مع حاضنة تعيين إلى 28.5 درجة مئوية والصورة لمدة تصل إلى 55 ساعة. لتصوير عدة أجنة في وقت واحد، استخدم محول خشبة يحمل عدة أطباق ويدور الأطباق واحدا تلو الآخر بحيث يتم وضع الأجنة أفقيا.
حدد هدف التكبير المنخفض، ثم حدد مكان الأجنة باستخدام العدسة وقم بمحاذاتها أفقيًا في النهاية عن طريق تدوير الأطباق. تسجيل موقع embryos'في البرنامج وإنشاء اسم ملف لحفظ البيانات تلقائيًا. قم بتعيين حجم الثقب وسرعة المسح الضوئي وحجم الصورة والتكبير/التصغير.
ثم حدد تكبير أعلى لالتقاط الصور وقنوات التألق ليتم تصويرها. لكل قناة، ضبط قوة الليزر والجهد العالي للكشف التأكد من جمع أفضل نطاق ممكن مع تجنب التشبع والحد من تبييض الصور. بعد ذلك ، لتصوير الجنين بأكمله بهدف 10X ، قم بتعيين إعدادات التقاط الصور الكبيرة في البرنامج لصورة العديد من حقول الرؤية وخيطها معًا لضبط موضع الجنين للتأكد من أنه يناسب منطقة الصورة الكبيرة هذه.
تكوين الإعدادات لالتقاط مكدسات Z وفقاً لتوجيهات المخطوطة. من أجل الحفاظ على تركيز الأجنة المتعددة خلال التصوير طويل الأجل الفاصل الزمني ، استخدم تركيزًا آليًا وضبط مستويات الإزاحة الفردية لكل جنين للتركيز على المستوى المرجعي. ثم قم بإعداد معلمات الفاصل الزمني في برنامج المجهر على صورة لمدة 55 ساعة على فترات ساعة واحدة.
في كل دورة، التقاط مجموعتي بيانات الجنين بشكل تسلسلي وحفظ البيانات تلقائيا. استخدام برنامج المجهر لمعالجة الصور. إذا تم تصوير أكثر من جنين واحد، قم بإنشاء ملفات مستقلة لكل جنين عن طريق تقسيم مجموعات البيانات استنادًا إلى موقع التصوير.
قم بتحويل مجموعات البيانات الزمنية ثلاثية الأبعاد إلى مجموعات بيانات زمنية 2D باستخدام إسقاطات الحد الأقصى للكثافة أو أداة مشابهة. وأخيراً، قم بإنشاء ملفات الأفلام عن طريق الحفظ كـ AVI وتحديد الخيار لا ضغط مع فواصل زمنية 200 مللي ثانية لسرعة تشغيل خمسة إطارات في الثانية. هذه الطريقة التركيب الطبقات يجعل من الممكن لصورة الأجنة حمار وحشي في حين تسمح لهم بالنمو ولكن في نفس تقييد حركتهم.
إذا كان تركيز الأاروز مرتفعًا جدًا ، تصبح الأجنة مشوهة. ولكن إذا كان منخفضا جدا، فإنها سوف تتحرك من مجال الرؤية خلال المجهر الفاصل الزمني. تم العثور على التركيز الأمثل agarose ليكون بين 0.028 و 0.034٪ حية المحارم الزبرئية المعدلة وراثيا التعبير عن RFP في الجنين بأكمله وGFP في الخلايا البطانية من الأوعية الدموية تم تصويرها لمدة 55 ساعة خلالها انبت السفينة بين الطوائف، وضعت تحت الأمعاء والرأس الأوعية الدموية، والتكثيف الضفير الوريدي السد مع تمديد الجذع حدث.
تم تصوير الأجنة التي تعبر عن GFP والخلايا العصبية الحركية لتصور تطور الخلايا العصبية الحركية. تنبت محاور الخلايا العصبية الحركية من الأنبوب العصبي البطني فوق السونيت نحو الجانب البطني للجنين. تم تصوير التطوير المشترك لـ dorsal من محاور عصبية المحرك فيما يتعلق بموقف الأوعية بين الطوائف باستخدام تكبير أعلى.
هذا جعل من الممكن تصور أدق التفاصيل من محور عصبي البطن تنبت وكذلك محور الدوران الظهرية تنبت من الأنبوب العصبي. كما زادت أعداد somite، و somites تمتد أيضا في الطول والعرض. وقد صورت هذه العملية باستخدام أجنة المعدلة وراثيا تعبر عن GFP في العضلات.
لأن التركيز الأمثل من agarose ضيقة جدا، أنها حساسة جدا للاختلافات الصغيرة في القياسات عند إعداد حل الأسهم من agarose وأنه يحتاج إلى إعادة تعريف لكل دفعة جديدة من حل agarose. من المهم بعناية تعيين المعلمات التصوير بما في ذلك حجم الصورة والقرار، وسرعة المسح الضوئي، والتكبير، وكاشف الجهد العالي، وقوة الليزر لضمان الاتساق بين التجارب وأيضا للحد من إمكانية سمية الصورة وتبييض الصور خلال التصوير الفاصل الزمني على المدى الطويل. باستخدام هذه الطريقة تصاعد لأجنة الحمير الوحشية المعدلة تليها التصوير الفاصل الزمني الموسعة للكائن الحي كله، يمكننا تصور كيفية تطور الأنسجة المختلفة معا.
