الزجر العصبي في العديد من الاضطرابات العصبية هي عملية مزمنة من الألياف العصبية التي غالبا ما يحدث قبل فقدان الجسم الخلية. يوفر القياس الكمي التقليدي للألياف العصبية في ثلاثة أبعاد طريقة حساسة ودقيقة للكشف عن التغير العصبي المبكر. هذه التكنولوجيا تستخدم موثوقة وفعالة على أساس الكمبيوتر غير متحيزة تجزئة كرات الفضاء لقياس أطوال من الهياكل مثل خط مثل ألياف الخلايا العصبية في 3D.
إظهار الإجراء سيتم من قبل برابهاكار سينغ، وهو ما بعد الطبيب وخبيرنا في علم الستيريو، وديفيد بنغ، مساعد البحوث في مختبري. بعد التأكد من عدم وجود استجابة لدواسة منعكس في الماوس تخدير، transcardially perfuse مع ما يقرب من 50 ملليلتر من الجليد الباردة 0.1 DPBS الضرس، تليها ما يقرب من 25 ملليلتر من 4٪ PFA في 0.1 PBS الضرس. في نهاية التسريب، بعد إصلاح الدماغ في وعاء من 4٪ PFA الطازجة لمدة 24 ساعة في أربع درجات مئوية.
في اليوم التالي، وغسل الدماغ مع ثلاثة واحد إلى اثنين من غسل دقيقة في DPBS الطازجة في غسل ونقل الدماغ إلى 15٪ السكروز في حل 0.1 DPBS بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، ضع الدماغ في محلول السكروز بنسبة 30٪، و 0.1 DPBS الضرس لمدة 48 ساعة عند أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة، نقل الدماغ إلى غرفة cryotome تعيين مسبق إلى ناقص 20 درجة مئوية.
يمكن الاحتفاظ بالأدمغة في أنابيب مختومة وتخزينها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية. للقطع، تضمين عينة الأنسجة في درجة حرارة القطع المثلى تضمين المتوسطة وجبل العينة على قرص عينة. ثم الحصول على أقسام سميكة 30 ميكرومتر المسلسل في طائرة إكليلية في cryotome، ونقل كل قسم إلى آبار فردية من لوحة ثقافة 24 جيدا تحتوي على محلول cryoprotectant استعدادا للتخزين ناقص 20 درجة مئوية.
لتحديد القسمين الأول والأخير من كل دماغ، قارن بين الميزات المورفولوجية مع أطلس دماغ الماوس القياسي. يبدأ NBM عند الـbregma ناقص 0.0 ملليمتر وينتهي عند ناقص 1.6 ملليمتر. اختيار كل قسم ثامن تسفر عن ما مجموعه ستة إلى سبعة أقسام ويسمح بمعامل الخطأ المناسب لكل من حجم والألياف طول التقدير.
لوضع العلامات المناعية الكيميائية من أقسام الأنسجة، بعد حجب أي الربط غير محدد مع مصل الأبقار الطبيعية 10٪في 0.1٪ تريتون X-100 في محلول ملحي تريس المخزنة، تسمية المقاطع مع الأجسام المضادة الأولية من الفائدة لمدة 48 ساعة في أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة، وغسل أقسام ثلاث مرات لمدة ثلاث دقائق في الملح الطازجة تريس المخزنة في كل غسل، تليها الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية الحيوية المناسبة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وغسل الأقسام ثلاث مرات في المالحة الطازجة تريس المخزنة كما هو موضح، تليها تلطيخ مع مجمع أفيدين بيوتين peroxidase و DAB بيروكسيديز محلول الركيزة وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.
بعد الغسيل، قم بتركيب جميع الأقسام من عينة أنسجة الدماغ على شريحة هلامية واحدة وتسمح للعينات بالهواء الجاف. لتجفيف المقاطع، غمر العينات مرتين لمدة خمس دقائق لكل تخفيف في حلول الإيثانول التصاعدية المتتابعة كما هو مبين، تليها إزالة مع اثنين من غسلات الزيلين لمدة 10 دقائق. ثم استخدم متوسطة تركيب مناسبة لوضع الأغطية على الشرائح.
بالنسبة لعلم الستيرولوجيا، افتح دراسة جديدة في البرنامج. سيتم فتح مربع حوار تهيئة الدراسة. املأ معلومات الدراسة وتأكد من تحديد الكسور متعددة المستويات.
انقر نقراً مزدوجاً فوق وحدة التخزين لفتح مربع الحوار حول وحدة التخزين. اسم ميزة الفائدة وحدد المنطقة نقطة عد التحقيق وانقر فوق التالي. انقر نقراً مزدوجاً فوق طول وتوفير اسم الميزة.
حدد الفضاء التحقيق وانقر فوق المقبل. في مربع تهيئة الحالة، لتعيين مجموعة التعليمات البرمجية قبل بدء الدراسة، العدد الإجمالي لأقسام بدءاً من القسم الأول الذي يحتوي على منطقة ذات أهمية إلى المقطع الأخير الذي يحتوي على منطقة الاهتمام وفاصل أخذ عينات القسم إلى ثمانية. انقر بجوار لفتح مربع حوار تهيئة التحقيق الذي سيقوم تلقائيًا بتعيين أقل التكبير لتحديد المنطقة وتقدير حجمها وتأكيد الإعدادات.
انقر فوق معاينة للتحقق مما إذا كان يمكن تحديد المنطقة ذات الأهمية في التكبير الأدنى المحدد. أدخل 50، 000 مكعب ميكرومتر لكل نقطة لكسر حجم المنطقة وانقر فوق معاينة وفعل. تحت تكبير الكائن عالية، تعيين الطول إلى 63X ومزدوجة انقر فوق طول لفتح مربع الحوار طول المجال.
تعيين قطر هذه الكرة إلى 10 ميكرومتر وانقر فوق القيام به. تعيين القيم المناسبة لمنطقة الإطار وارتفاع الإطار ومنطقة الحماية وتباعد الإطار. ثم انقر فوق التالي واتبع الإرشادات التي يوفرها البرنامج.
لإدراج المقطع الأول، ضع الشريحة على مرحلة المجهر تحت هدف 5X وانقر فوق السهم الأخضر لرسم حدود عشوائية حول NBM لتحديد منطقة الاهتمام. انقر فوق السهم الأخضر وفعل لتغيير الهدف 63X للحصول على قياسات الألياف من الكسر الحالي. سيظهر مربع حوار سمك المقطع.
تعيين السطح العلوي والسفلي من القسم لقياس سمك الفعلي للقسم باستخدام مقبض التركيز دليل محور ع وانقر على القيام به. حرك المحور z ببطء من أعلى إلى أسفل في ارتفاع الإطار من القسم لوضع علامة على جميع الألياف المتقاطعة على سطح مسبار المجال الظاهري. عندما تم وضع علامة على جميع الألياف، انقر بجوار التقدم إلى الموقع التالي.
عند اكتمال كافة الكسور، انقر فوق السهم الأخضر. سيطلب البرنامج إدراج القسم التالي. جلب العينة التالية على الشريحة في التركيز باستخدام الهدف 5X وتكرار قياس الألياف كما هو موضح للتو.
عندما يتم قياس جميع الأقسام، فإن البرنامج سوف يولد نتيجة للحالة التي تظهر معامل قيم الخطأ. إذا كان معامل الخطأ مقبولاً، انتقل إلى الحالة التالية. إذا كان معامل الخطأ غير مقبول، فإن البرنامج سيقدم توصيات لتغيير بعض المعلمات.
عندما يتم الانتهاء من جميع الحالات، توليد نتائج لكل حالة وكل مجموعة. في هذه التجربة التمثيلية ، أظهرت مجموعة بروتين السلائف بيتا الأميلويد المتحولة السويدية انخفاضًا ملحوظًا في طول الألياف وكثافة طول الألياف مقارنة بزملائهم في القمامة من النوع البري. كما أظهرت النتائج أنه لم يكن هناك فرق كبير في حجم البنك الوطني بين المجموعتين التي تم تحليلها.
هذه التقنية تتطلب السليم اقتناء في الاتجاه الصحيح وطريقة تلطيخ جيدة مع فترة الحضانة. يمكن استخدام بروتوكول علم المجسمات لتقدير أي ملامح خطية مثل ألياف الخلايا العصبية الأخرى، والعمليات الفلكية، أو حتى ملامح الأوعية الدموية.
