小鼠大脑细胞核巴沙里斯中胆碱能纤维长度的立体估计

许多神经系统疾病的神经分裂是一个慢性过程，神经纤维损失往往发生在细胞体丧失之前。三维神经纤维的病理学定量为检测早期神经退行性变化提供了一种敏感而准确的方法。该技术利用可靠、高效的基于计算机的空球无偏分馏，测量3D中神经元纤维等线样结构的长度。

演示程序将由博士后、我们的立体学专家普拉巴卡尔·辛格和实验室研究助理大卫·彭完成。在确认麻醉小鼠对踏板反射缺乏反应后，转心性循环与大约 50 毫升的冰冷 0.1 摩尔 DPBS，随后在 0.1 摩尔 PBS 中循环使用约 25 毫升 4%PFA。灌注结束时，在4摄氏度下将大脑固定在新鲜4%PFA的容器中24小时。

第二天，用三到两分钟的新鲜DPBS洗净大脑，并在0.1 DPBS溶液中将大脑转移到15%蔗糖溶液中过夜。第二天早上，将大脑放入30%蔗糖溶液和0.1摩尔DPBS中，在4摄氏度下48小时。在孵育结束时，将大脑转移到预设置为零下20摄氏度的低温腔室。

大脑可以保存在密封的管子里，储存在零下80摄氏度。对于剖面，将组织样品嵌入最佳切割温度嵌入介质中，并将样品安装到试样盘上。然后在低温的日冕平面上获取30微米厚的连续部分，将每个部分转移到含有低温保护溶液的24孔培养板的单个孔中，为零下20摄氏度的储存做准备。

要识别每个大脑的第一个和最后一个部分，比较形态特征与标准的小鼠大脑图集。NBM 从百分之零零零零毫米开始，到负 1.6 毫米。选择每第八节共产生六到七个部分，并允许一个适当的误差系数的体积和光纤长度估计。

对于组织部分的免疫组织化学标记，在三叶以下盐中 0.1% Triton X-100 中阻断任何非特异性结合后，在 4 摄氏度下用感兴趣的初级抗体标记这些部分 48 小时。在孵化结束时，每次洗涤用新鲜三酯缓冲盐水洗三次，三分钟，然后用适当的生物基化二次抗体在室温下孵育一小时。在孵化结束时，按照制造商的协议，在新鲜的Tris缓冲盐水中洗涤三次，然后使用Avidin生物素过氧化物酶复合物和DAB过氧化物酶基板溶液进行染色。

洗涤后，将一个脑组织样本的所有部分安装到一个明胶化幻灯片上，让样品风干。要使部分脱水，请将样品浸入两次，每次稀释五分钟，如所示，在连续上升乙醇溶液中，然后用两次10分钟的二甲苯洗涤进行清除。然后使用适当的安装介质将盖玻片放在幻灯片上。

对于立体学，在软件中打开一个新的研究。将打开一个研究初始化对话框。填写研究信息，确认选择了基于多级分数。

双击音量可打开音量对话框。命名感兴趣的要素并选择区域点计数探测器，然后单击下一步。双击长度并提供功能的名称。

选择球体探测并单击下一步。在"初始化"框中，若要在开始研究之前对组进行编码，请将从第一节开始包含感兴趣区域的节到包含感兴趣区域的最后一节和包含感兴趣区域的节采样间隔设置为 8 的部分总数。单击"旁边"以打开探针初始化对话框，该对话框将自动设置区域选择和体积估计的最低放大倍率，并确认设置。

单击预览以检查能否在选定的较低放大率下识别感兴趣的区域。输入区域卷分数每个点 50，000 微米立方体，然后单击预览并完成。在对象高放大倍率下，将长度设置为 63 倍，双击长度以打开长度球体对话框。

将球的直径设置为 10 微米，然后单击完成。为帧区域、帧高度、防护区域和帧间距设置适当的值。然后单击"下一步"，然后按照软件提供的说明进行操作。

要插入第一部分，请将幻灯片放在 5X 目标下的显微镜舞台上，然后单击绿色箭头以在 NBM 周围绘制任意边界以定义感兴趣区域。单击绿色箭头并更改 63 倍目标以获取当前分数的光纤测量值。将显示节厚度对话框。

使用手动 z 轴对焦旋钮设置截面的顶部和底部表面，以测量截面的实际厚度，然后单击完成。在剖面的框架高度中缓慢地将 z 轴从上到下移动，以标记虚拟球体探头表面的所有相交光纤。标记所有光纤后，单击"旁边"以前进到下一个位置。

完成所有分数后，单击绿色箭头。软件将要求插入下一节。使用 5X 目标将幻灯片上的下一个样本集中到焦点上，并重复刚刚演示的光纤测量。

测量所有部分后，软件将生成显示误差值系数的情况的结果。如果误差系数可以接受，请继续执行下一个情况。如果误差系数不可接受，软件将提供更改某些参数的建议。

完成所有案例后，将生成每个案例和组的结果。在这个具有代表性的实验中，瑞典突变β淀粉样蛋白蛋白组表明，与野生型垃圾伴侣相比，纤维长度和纤维长度密度显著降低。结果表明，两组分析的NBM体积无显著差异。

该技术要求在正确的方向和良好的染色方法与潜伏期适当的采集。立体学方案可用于估计任何线性轮廓，如其他神经元纤维、星细胞过程，甚至血管轮廓。