المتغير مستعمرة صغيرة أو تقنية SCV يسمح لاختيار ونمو المتغيرات مستعمرة صغيرة من aeruginosa Pseudomonas. الأسلوب هو نهائي جدا ويسمح لاختيار أسهل من الطرق العادية. هذا البروتوكول أيضا تفاصيل أكثر أمنا, طريقة أكثر حساسية ELISA للحصول على كمية alginate بالمقارنة مع طريقة الكربزول حمض أورونيك القياسية, تمكين الكم alginate مباشرة في العينات دون الكي أو معالجة العينة.
ومن خلال هذا الإجراء سيكون براندون كيربي، وهو فني مختبر، وروي الأحمر، وهو طالب دراسات عليا من مختبري. للكشف عن متغير مستعمرة صغيرة أو SCV، خط الأول سلالة P.aeruginosa سلالة PAO1 دلتا PYRD على لوحات PIA ساخنة مسبقا. تنمو سلالات في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
على لوحة النمو، تحديد عزل مستعمرة واحدة التي لديها النمط الظاهري SCV تتميز بحجم مستعمرة من واحد إلى ثلاثة ملليمترات بدلا من حجم المستعمرة العادية من ثلاثة إلى خمسة ملليمترات. إعادة خط المستعمرات المختارة للحصول على عزل نقي من SCV. لتنفيذ التفعيل الفسيولوجي لمسار الإنقاذ، استخدم حلقة تطعيم عقيمة لاختيار مستعمرة SCV من لوحة PIA.
خط المستعمرة المختارة على لوحة PIA ساخنة مسبقًا مكمّلة بـ 0.1 ملليمولار أوراسيل. تنمو لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 24 إلى 48 ساعة. لبدء اختبار الكاربزول حمض uronic، وتحديد مستعمرة واحدة من ثقافة نقية من سلالة المطلوب أن يتم اختبارها واختيار مستعمرة باستخدام مسواك معقمة.
ضع المسواك في أنبوب اختبار ثقافة يحتوي على خمسة ملليلترات من PIB. تنمو في حاضنة شاكر في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد الحضانة، أضف aliquot من مرق PIB مثقف على لوحة PIA ساخنة مسبقا.
باستخدام موزع الخلايا العقيمة، ونشر مرق على لوحة وتنمو في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. باستخدام وحدة تحكم ماصة والماصات 50 ملليلتر معقمة، إضافة 0.85٪ كلوريد الصوديوم إلى العشب الكبار وجمع العينة عن طريق كشط لوحة باستخدام موزع الخلية. استلهم العينة باستخدام ماصة جديدة 50 ملليلتر ونقلها إلى أنبوب جمع 50 ملليلتر.
دوامة العينة على ارتفاع لخلط ووضع العينات على الجليد. لقياس OD600 من العينات، أولا فارغة الطيفي باستخدام ملليلتر واحد من كلوريد الصوديوم 0.85٪. ثم إضافة ملليلتر واحد من العينة إلى cuvette جديدة يمكن التخلص منها وقراءة OD. كرر هذه الخطوة مرتين للحصول على ثلاث مرات من القراءة لكل عينة.
الآن إضافة ثلاثة ملليلتر من محلول بورات حمض الكبريتيك في أنابيب الثقافة والسماح للجلوس على الجليد. إضافة 350 ميكرولترات من العينة التي تم جمعها ببطء إلى خليط حمض في أنابيب الاختبار. بعد دوامة لفترة وجيزة على انخفاض، إضافة 100 ميكرولترات من 0.1٪ كاربازول والمحلول الإيثانول إلى خليط عينة حمض.
اِكِلَ الأنبوب و الدوامة على الإعداد المتوسط لمدة خمس ثوانٍ. ثم وضع في حمام جاف في 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، دوامة الأنابيب لفترة وجيزة على ارتفاع والسماح لتبرد لمدة خمس دقائق.
استخدام أنبوب مع 0.85٪ كلوريد الصوديوم كفراغ إلى مقياس الطيف. ثم يضاف ملليلتر واحد من الخليط إلى cuvette نظيفة وقراءة OD من العينات في 530 نانومتر على مقياس الطيف. إعداد منحنى قياسي من خلال قياس OD530 من التخفيفات التسلسلية من تركيزات معروفة من حمض d-mannuronic.
كرر مرتين واستخرج معادلة خطية من هذه القراءات. حساب تركيز الحدين في كل عينة باستخدام المنحنى القياسي وتقسيم تركيز الحد من معادلة خطية بواسطة OD600 للحصول على المبلغ الإجمالي من alginate لكل OD600. باستخدام ميكروسيبيت، إضافة 50 ميكرولترات من العينة التي تم جمعها إلى لوحة 96 جيدا غير المعالجة.
ثم إضافة 50 ميكرولترات من عازلة طلاء ELISA إلى الآبار. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. باستخدام زجاجة بخ، وغسل آبار لوحة مرتين مع برنامج تلفزيوني-T عن طريق ملء الآبار ومن ثم استنزاف لهم عن طريق التقليب لوحة أكثر.
إضافة 200 ميكرولترات من العازلة سد إلى الآبار مع micropipette واحتضان في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، وغسل لوحة مرتين مع برنامج تلفزيوني-T كما كان من قبل. ثم إضافة 100 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية المخففة إلى الآبار واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين.
بعد الحضانة، وغسل الآبار لوحة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني-T كما كان من قبل. بعد ذلك، أضف 100 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية المخففة إلى الآبار واحتضانها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين. بعد غسل لوحة مرة أخرى ثلاث مرات، واستخدام micropipette لإضافة 100 ميكرولترات من TMB ELISA الحل.
احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام عن طريق وضع لوحة في درج أو التفاف في احباط. ثم إضافة 100 ميكرولترات من حل التوقف. استخدم قارئ لوحة لقياس الـ OD عند 450 نانومتر.
إنتاج منحنى قياسي من خلال قياس OD450 من التخفيفات التسلسلية من تركيزات معروفة من حمض d-مانيوروك. كرر القياسات مرتين واستخرج معادلة خطية. حساب تركيز الحدين في كل عينة باستخدام المنحنى القياسي وتقسيم تركيز الحدس من المعادلة الخطية بواسطة OD600 للحصول على المبلغ الإجمالي من alginate لكل OD600.
يظهر هنا عينات PAO581 و PAO581 مع طفرات في الجينات التي تنظم البيريمدين دي نوفو البيولوجية نمت على PIA و PIA تكملها 0.1 ملليمولر من uracil. وتظهر البيانات أن وجود uracil في وسائل الإعلام يؤدي إلى تحويل سلالة متحولة مرة أخرى إلى mucoidy كما رأينا من قبل إنتاج alginate المستعادة. هنا، تظهر النتائج لمضادات alginate أحادية النسيلة المضادة للجسم القائم على ELISA.
وتزرع المستعمرات على لوحات PIA مع arabinose لالتدرابينز للتحريض من المروج PBAD وpHERD-20T plasmid. هي PAO1، PAO1 تحمل التعبير pHERD-20T مع alginate عامل سيغما محددة الرئيسية algU، و PAO1 مع حذف في الإطار من الجين algD في ترميز مفتاح ALGINATE البيولوجية إنزيم الناتج المحلي الإجمالي الناتج المحلي الإجمالي-mannose dehydrogenase. وتقارن هذه البيانات بين مستويات اللا mucoid من alginate مقاسة لـ PAO1 و PAO1 delta algD مقابل مستويات mucoid من alginate مقاسة لـ PAO1 مع pHERD-20T algU.
كما تم اختبار مضادات الجينات ELISA على عينات البلغم المريض دون نمو مسبق على لوحات. وأظهرت ثلاث عينات من البلغم CF التي كان نمو P.aeruginosa mucoid alginate يمكن الكشف عنها مقارنة مع اثنين من عينات البلغم المريض التي تحتوي إما غير موكود P.aeruginosa أو أي نمو P.aeruginosa. إعداد منحنيات القياسية للكمية alginate أمر بالغ الأهمية لأن هذا سيسمح لقياس دقيق ودقيق من alginate داخل العينة.
إن محلول الحمض المستخدم في طريقة الكرباسول خطيرة جداً، لذا يجب استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة والاحتياطات لضمان السلامة. بعد عزل SCVs، يمكن القيام بمزيد من التنميط الجيني لفهم الطفرات التي تحدث والأمراض المرتبطة بهذه الطفرات بشكل أفضل. يمكن تكييف طريقة ELISA لمراقبة عدوى الرئة المزمنة في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي.
وعلاوة على ذلك، يمكن أن تساعد طريقة النمو لدينا في تشخيص العدوى الناجمة عن حالات عدوى محددة.
