تظهر أسماك الحمار الوحشي كنموذج فقري ممتاز لدراسة أحداث الكروموسومات من النخاع بما في ذلك الاقتران الكروموسومات المتماثلة ، المشبك والمتلفز. وقد مكننا هذا البروتوكول انتشار السطح النووي لنا من تصور السمات الرئيسية للهندسة الكروموسومية meiotic باستخدام المجهر فائقة القرار. يمكن للباحثين أن يتوقعوا مئات النوى المنتشرة بشكل جيد لكل شريحة مع حطام أقل من بروتوكولات انتشار أسماك الحمار الوحشي الأخرى.
الجزء الأكثر تحديا من الناحية الفنية من هذا الإجراء هو تشريح الخصيات حمار وحشي كما هو على مقربة من الجلد، وأيضا تعلق على الأجهزة الأخرى. سيسمح تصور إجراء التشريح للباحثين بمعرفة ما يمكن توقعه عندما يرون الجان جزءا لا يتجزأ من نسيج الحيوان. بعد القتل الرحيم الحمار الوحشي الذكور، قطع رأس سمكة واحدة في وقت واحد مع مقص صغير ومن ثم استخدام مقص صغير لقطع على طول خط الوسط البطني لفضح تجويف الجسم.
وضع الأسماك في طبق بيتري المغلفة السيليكون وتغطية من قبل بركة ضحلة من 1X PBS. تحت المجهر في التكبير 1.65X، تشريح الخصيات باستخدام ملقط. إزالة قدر الدهون والأنسجة المحيطة بها من الخصيات ممكن.
سوف تظهر الخنة شفافة تحت ضوء نطاق تشريح بينما قد يكون الدهون المحيطة بمظهر أغمق قليلا. قد يتم ترك بعض الدهون على الزناد دون إعاقة الإجراء. إضافة كل الخصيتين تشريح مباشرة في أنبوب خمسة ملليلتر مع ملليلتر اثنين من DMEM والحفاظ على الجليد.
لتفكك خلايا الخصية، إضافة 200 ميكرولترات من محلول الكولاجيناز إلى أنبوب المليلتر خمسة مع الخصيات. اخلطي الحل عن طريق عكسه عدة مرات. هز الخصيتيها برفق في حاضنة شاكر أفقياً عند 100 دورة في الدقيقة عند 32 درجة مئوية.
عكس بسرعة أنبوب كل 10 دقائق لتسهيل تفكك. بعد ساعة، DMEM غائم والخصيتان في قطع صغيرة. في حين يتم احتضان الخصيتان في الكولاجيناز، قبل 100 ميكرولترات من 0.1 محلول السكروز الضرس إلى 37 درجة مئوية.
لغسل الكولاجيناز، إضافة DMEM إلى حجم النهائي من خمسة ملليلتر وعكس الأنبوب عدة مرات. بيليه الخصيتين في 200 غرام لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة ثلاثة ملليلترات من عظمى بحيث تبقى فقط ملليلتر اثنين.
كرر غسل DMEM مرتين إضافيتين. بعد غسل DMEM الماضي، وإزالة أربعة ملليلتر من عظمى وإضافة ملليلتر واحد من DMEM، 200 ميكرولترات من حل التربسين، و 20 ميكرولترات من الحل DNase I. عكس أنبوب عدة مرات لخلط الحل.
هز أفقيا الأنبوب في 32 درجة مئوية في 100 دورة في الدقيقة. عكس أنبوب بسرعة كل خمس دقائق لتسهيل تفكك. بعد خمس إلى 15 دقيقة، يحتوي الحل DMEM على كتل قليلة فقط.
إضافة 500 ميكرولترات من محلول مثبطات التربسين و 50 ميكرولترات من الحل DNase I. عكس أنبوب عدة مرات لخلط ثم تدور لفترة وجيزة أسفل في 200 غرام لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة السائل أو كتل التي قد تلتصق بغطاء أنبوب أو جانب الأنبوب. وضع أنبوب على الجليد وإعادة تعليق الخلية عن طريق الأنابيب مرارا وتكرارا صعودا وهبوطا مع ماصة نقل البلاستيك لمدة دقيقتين لتسهيل تفكك أي كتل المتبقية.
تأكد من أن تعليق الخلية لا يذهب إلى لمبة من ماصة نقل. ثم قبل الرطب مصفاة خلية 100 ميكرون مع DMEM ووضعها على رأس أنبوب 50 ملليلتر على الجليد. نقل تعليق الخلية من خلال مصفاة قطرة واحدة في وقت واحد باستخدام ماصة نقل البلاستيك.
نقل الترشيح باستخدام ماصة نقل البلاستيك إلى أنبوب جديد خمسة ملليلتر. تأكد من جمع الخلايا المجمعة المرفقة في الجانب السفلي من المرشح. إضافة DMEM في أنبوب إلى حجم النهائي من خمسة ملليلتر.
بيليه الخلايا في 200 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة أكبر قدر من supernatant ممكن دون إزعاج بيليه وإضافة خمسة microliters من DNase أنا الحل مباشرة في بيليه. ثم اخلط البيليه مع محلول DNase I عن طريق كشط الجزء السفلي من الأنبوب من أربع إلى خمس مرات على طول رف أنبوب microcentrifuge فارغ.
إضافة DMEM إلى حجم النهائي من خمسة ملليلتر وخلط الحل عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات. بيليه تعليق الخلية في 200 غرام لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. تكرار العلاج DNase إضافية واحدة إلى ثلاث مرات حتى بيليه resuspended لا تكتل عند إضافة DMEM.
بعد آخر تدور، وإزالة أكبر قدر من عظمى ممكن دون إزعاج بيليه. بعد ذلك، إضافة ملليلتر واحد من 1X PBS و resuspend بيليه عن طريق كشط بلطف الجزء السفلي الخارجي من الأنبوب على طول رف أنبوب فارغ. بيليه تعليق الخلية في 200 غرام لمدة خمس دقائق ثم إزالة أكبر قدر ممكن من اللقلق دون إزعاج بيليه.
قطع ثلاثة ملليمترات من نهاية 200 ميكرولتر ماصة تلميح لتوسيع الفتحة. مع تلميح المقزة قطع، resuspend بيليه في 80 ميكرولترات من 0.1 محلول السكروز الضروس من قبل pipetting صعودا وهبوطا. دع تعليق الزنزانة يجلس في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق.
المقبل، مع طرف ماصة، معطف شريحة واحدة مع 100 ميكروليتر من 1٪ الفورمالديهايد مع 0.15٪ تريتون X-100. ثم إضافة 18 ميكرولترات من تعليق الخلية السكروز على وسط الشريحة في خط مستقيم عمودي على الحافة الطويلة. إمالة الشريحة ذهابا وإيابا لتسهيل انتشار تعليق الخلية إلى جميع الزوايا.
ضع الشرائح مسطحة في غرفة رطوبة مفتوحة متصدعة قليلاً لمنع محلول الفورمالديهايد من التجفيف. ضع غرفة الرطوبة في درج مظلم بين عشية وضحاها. في الصباح، قم بإزالة الغطاء من غرفة الرطوبة والسماح للشرائح بالجفاف الكامل.
ضع الشرائح في جرة كوبلين ثم املأ جرة الكوبلين بالماء المقطر. احتضان لمدة خمس دقائق مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة. صب الماء وملء جرة مع واحد إلى 250 وكيل التبول.
اغسل مرتين لمدة خمس دقائق مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة. السماح للشرائح لتجف تماما وتخزينها في ناقص 20 درجة مئوية حتى أنها ملطخة. حدد هذا البروتوكول طريقة لإعداد وتصور انتشار الحيوانات المنوية ذات المحار الوحشي الذي ينتج نوات غير متداخلة بشكل جيد.
تظهر اللوحات على اليسار ثلاث مراحل من الطور الظهاري، اللبوتين، الزيغوتين في وقت مبكر، وpachytene. كانت التيلوميرات ملطخة أرجواني لكل مرحلة. مثال على الفوارق ذات النوعية الرديئة بسبب عدم كفاية علاجات DNase I تظهر هنا.
الكروموسومات Meiotic الملطخة لSYCP3 تشير إلى تداخل النوى بسبب تعليق خلية السكروز اللزجة التي تمنع الخلايا من الانتشار بشكل صحيح على الشريحة. من المهم جدا أن تبدأ مع المبلغ الصحيح من المواد بدءا، علاج الخصيصات حمار وحشي للحصول على كمية مناسبة من الوقت في التربسين، وتنفيذ العدد اللازم من العلاجات DNase I كما فشل في القيام بذلك يمكن أن يؤدي إلى عدد قليل جدا من النوى أو نواة تكتل. وينبغي دائماً ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند العمل مع الفورمالديهايد.
بعد عملية الانتشار، يمكن أن تكون ملونة الكروموسومات لتصور مختلف هياكل الكروموسومات، فضلا عن فواصل حبلا مزدوج لتحليل اعتماد توقيت وتوطين الأحداث meiotic. وقد مهدت أسلوبنا الطريق لإظهار أن حمار وحشي قد يكون نموذجا أفضل من الحيوانات المنوية البشرية من الماوس على أساس ملامح الكروموسوم وباقة التيلومير.
