يتم التحكم في التنظيم الدقيق للجينات الزمانية من خلال عناصر تنظيمية متنوعة لرابطة الدول المستقلة التي تتفاعل بينها. بروتوكولنا يجعل من الممكن استجواب كميا chromatin الاتصالات من loci مختارة مثل المروجين. هذه التقنية تسمح لنا بتحديد وقياس ترددات التفاعل بين مختلف العناصر التنظيمية في وقت واحد.
لتوليد الأجسام الجنينية، تبدأ من خلال زراعة الخلايا الجذعية الجنينية الماوس إلى 60٪ التقاء. ثم إزالة المتوسطة الثقافة، وغسل مرتين مع ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني معقمة. إزالة برنامج تلفزيوني تماما، وإضافة ملليلتر اثنين من خلية مفرزة المتوسطة.
احتضان طبق الثقافة في 37 درجة مئوية. بعد الحضانة لمدة خمس دقائق، إضافة ثمانية ملليلتر من EB التمايز المتوسطة إلى الطبق. لتفكك المستعمرات mESC للحصول على تعليق خلية واحدة، ماصة المتوسطة صعودا وهبوطا 15 إلى 20 مرة، ونقل التعليق إلى أنبوب 10 ملليلتر.
الطرد المركزي الخلايا في 300 مرة ز في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم إزالة بعناية فائقة. بعد عد الخلايا، resuspend بيليه الخلية مع EB التمايز المتوسطة.
عكس غطاء طبق ثقافة طوله 15 سنتيمترًا. باستخدام ماصة متعددة القنوات سعة 200 ميكرولتر، قم بإيداع 20 ميكرولتر قطرات من الخلايا التي يتم إعادة تعليقها على الغطاء. عكس الغطاء بعناية، ووضعها على الجزء السفلي من طبق الثقافة.
احتضان الطبق مع قطرات شنقا لمدة ثلاثة أيام. لجمع الخلايا بعد الحضانة ، اغسل الغطاء بلطف مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. نقل برنامج تلفزيوني، والتي سوف تحتوي على EBs، إلى أنبوب بلاستيكي 50 ملليلتر.
بعد السماح للأنبوب الجلوس لمدة 30 دقيقة في درجات حرارة الغرفة، وإزالة بعناية فائقة. سيتم ترك الـ EBs في الجزء السفلي من الأنبوب. إعادة تثبيت بلطف في EBs 10 ملليلتر من تمايز EB جديدة المتوسطة.
نقل التعليق إلى طبق بتريولوجي 10 سنتيمترات. بعد ثلاثة إلى ستة أيام، استخدم مجهرًا مقلوبًا للتحقق من تكوين EB. يجب أن تكون الـ EBs مستديرة ومتجانسة في الحجم.
جمع EBs من اثنين أو ثلاثة أطباق 10 سنتيمترا في أنبوب بلاستيكي 50 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي في EBs 300 مرة ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة بعناية فائقة، وإعادة تعليق EBs في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني.
أجهزة الطرد المركزي في EBs 300 مرات ز في درجة حرارة الغرفة مرة أخرى، وهذه المرة لمدة ثلاث دقائق. إزالة ناظر، وإضافة ملليلترين من التربسين-EDTA إلى بيليه. احتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
خلال الحضانة، ماصة صعودا وهبوطا كل ثلاث دقائق للحصول على تعليق خلية واحدة. لوقف رد فعل التربسين، إضافة ثمانية ملليلتر من EB التمايز المتوسطة. بعد إعادة تعليق الخلايا في المتوسط EB الطازجة، إضافة شبهformaldehyde إلى تركيز نهائي من 1٪ احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة تحت التناوب.
Quench الفورمالديهايد بإضافة الجليسين إلى تركيز نهائي من 0.125 الضرس. أكمل عملية التثبيت كما هو موضح في المخطوطة، ثم قم بتجميد كريات الخلايا في النيتروجين السائل. إعادة بناء بلطف بيليه الخلية في عازلة الجليد الباردة الطازجة، ووضع الأنبوب على الجليد.
بعد 15 دقيقة، الطرد المركزي الخلايا في 1،000 مرات ز لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. تجاهل المابير، وغسل بيليه مع 500 ميكرولترات من عازلة التحلل الباردة. Resuspend بيليه في أنبوب 1.5 ملليلتر مع 50 ميكرولتر من 0.5٪ SDS في 1x العازلة اثنين، ووضع الأنبوب في كتلة التدفئة في 62 درجة مئوية.
بعد 10 دقائق، قم بإزالة الأنبوب من كتلة التدفئة، وأضف عازلة الهضم. تخلط جيدا عن طريق الأنابيب، وتجنب رغوة المفرطة، واحتضان أنبوب في 37 درجة مئوية. لضمان كفاءة الهضم الانزيم تقييد، في هذا البروتوكول، ونحن قد شملت خطوة متكررة من الهضم.
هذا هو السبب في أنه من المهم أيضا أن resuspend جيدا النوى في عازلة الهضم. إضافة 25 ميكرولترات أخرى من العازلة الهضم، مزيج عن طريق عكس، واتخاذ ثمانية ميكرولترات كتحكم غير مهضّم. تخزين عينة التحكم غير مهضومة في درجة مئوية سلبية 20.
المقبل، سوف تضيف عدة aliquots من إنزيم تقييد Mbol، احتضان في 37 درجة مئوية تحت التناوب بعد كل aliquot. خذ ثمانية ميكروليترات كعينة تحكم هضمية. إلى فك crosslink كلا العينات التحكم، إضافة 80 ميكرولترات من TE العازلة في 10 ميكرولترات من البروتينات K.Incubate في 65 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
للتحقق من كفاءة الهضم، قم بتشغيل 20 ميكرولتر على 0.6٪ هلام. الهضم الناجح تظهر شظايا في معظمها في نطاق أزواج 3.0 إلى 5.0 كيلو. إعداد الحمض النووي للتهيّد كما هو موضح في المخطوطة.
استخدام sonicator لقص الحمض النووي إلى حجم 150 إلى 700 قاعدة أزواج. نقل الحمض النووي القص إلى أنبوب قفل آمن جديد عادي، وتجميع سونيكيشنات متعددة من نفس العينة. إضافة الخرز تنقية الحمض النووي الدافئ في كمية تساوي 1.8 مرات حجم القائمة، ومزيج عن طريق resuspending.
بعد خمس دقائق من الحضانة، وجمع الخرز مع رف المغناطيسي. حفظ الأنابيب في رف المغناطيسي، وغسل الخرز مرتين مع ملليلتر واحد من الإيثانول الطازجة 80٪. بعد تجفيف الهواء الخرز في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق ، elute الحمض النووي عن طريق إعادة حفظ الخرز في 1x تريس العازلة.
وباستخدام طريقة الشنق والقط، تم الحصول على مجموعة متجانسة من الـ EBs بعد ستة أيام من تحريض تمايز ESC. تم إجراء جل الكهرباء في جميع أنحاء البروتوكول لمراقبة الجودة. كفاءة الهضم من قبل Mbol النتائج في أجزاء من أقل من ثلاثة أزواج كيلوبيس.
أظهر الكهربائي بعد الربط أن معظم الشظايا كانت أكبر من ثلاثة أزواج من قاعدة الكيلو. ومن المتوقع أحجام جزء من 400 إلى 500 أزواج قاعدة بعد سونيكيشن. بعد dephosphorylation وربط محول واحد نهاية، تم تنفيذ جولتين من PCR لتضخيم الأهداف ذات الاهتمام.
تم تضخيم كل هدف بشكل منفصل مع اثنين من أزواج التمهيدي مختلفة، A و B لملوس Pou5f1 و C و D لـ T. وأدى ذلك إلى تشويه الحمض النووي حول 400 زوج من القواعد. وبدلاً من ذلك، تم إجراء تعدد PCR لتضخيم الأهداف A و C في وقت واحد، مما أدى إلى حجم جزء مماثل بعد التنقية.
في هذه التشكيلات 4C، تشير مربعات زرقاء فاتحة إلى موقع القدرة مع التغيرات الديناميكية أثناء التمايز. مناطق كروماتين الاتصال المروجين للجينات Pou5f1 و T خلال التمايز EB. Pou5f1 كان الزّناء أثناء مفاضلة EB.
وعلى العكس من ذلك، تم رفع تنظيم T أثناء التمايز EB. إن الهضم الفعال للانزيمات المقيدة ثم ربط القرب من الحمض النووي الجينومي للعبور هي عوامل رئيسية لضمان نجاح هذا البروتوكول. شيء آخر هو تصميم التمهيدي لاستجواب خريطة الاتصال من كل مكان.
هذا الإجراء هو مناسبة بشكل مثالي لاستجواب chromatin الاتصال في loci المستهدفة. إذا كانت هناك حاجة إلى تغييرات عالمية ، يمكن إجراء نهج على نطاق الجينوم مثل Hi-C أو القبض على المروج Hi-C أو HiChIP.
