وتورط الخلايا الجذعية السرطانية في السرطان انتكست الانبثاث على مقاومة المخدرات. يوفر هذا البروتوكول طريقة فعالة للتحقيق في وظائف الجينات الرئيسية في الخلايا الجذعية السرطانية. باستخدام نظام الضربة القاضية المشروطة وتكييف المجال تشكيل الحسبة، يتم تكييف هذه الطريقة بسهولة لدراسة في المختبر وفي وظائف الجسم الحي على الجينات المرتبطة الجذعية في أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية السرطانية.
مما يدل على الإجراء ، وسوف يكون Yuting لي وشيانجيو تان ، ومساعدي البحوث من مختبري. لتوليد جزيئات فيروس العدس، بذور أربعة ملايين 293T خلايا التعبئة والتغليف العدسي في طبق بيتري 100 ملليمتر مع 10 ملليلتر من DMEM تكملها 10٪ FBS. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون، والتأكد من أن الخلايا هي 50 إلى 80٪ التقاء في يوم النقل.
جلب انخفاض في درجة حرارة المصل من المتوسط إلى درجة حرارة الغرفة وإعداد أنابيب A و B وفقا لاتجاهات المخطوطات. إضافة محتويات أنبوب A إلى أنبوب B.Mix جيدا واحتضان الأنبوب لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإعداد مجمعات الدهون والحمض النووي. إزالة خمسة ملليلترات من المتوسطة من طبق ثقافة الخلية.
ثم إضافة خمسة ملليلتر من مجمع الدهون والحمض النووي في طبق ثقافة الخلية إسقاط الحكمة ودوامة بلطف الطبق. احتضان طبق الثقافة لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الحضانة، وإزالة بعناية وسيط transfection واستبدالها مع 10 ملليلتر من DMEM قبل الدافئة تكملها مع 10٪ FBS.
احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة أخرى. ما يقرب من 48 ساعة بعد transfection، حصاد 10 ملليلتر من فيروس العدس التي تحتوي على عظمى وتصفية لهم مع 0.45 ميكرومتر صب مرشح لإزالة الحطام الخلوي. جميع الأوعية ثقافة الخلية، نصائح، والمرشحات والمحاقن قد تحتوي على فيروس العدس وينبغي أن تعامل مع 10٪ التبييض قبل التخلص منها.
نقل مُنَحَّد مُوضح إلى حاوية معقمة. أضف تركيز Lenti-X واخلطه مع انعكاس لطيف. احتضان الخليط في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
وفي اليوم التالي، تمّت الطرد المركزي في 1500 مرة من G لمدة 45 دقيقة عند أربع درجات مئوية. إزالة بعناية فائقة، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه في الجزء السفلي. بلطف إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من DMEM تكملها 10٪ FBS وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية.
بذور 6 ملايين الخلايا الجذعية سرطان المعدة أو GCSC في طبق بيتري 100 ملليمتر مع 10 ملليلتر من DMEM تكملها 10٪ FBS. زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. عندما تصل الخلايا إلى 70 إلى 80٪ التقاء, التعرق المتوسطة من الطبق وإضافة جزيئات الرونتيفيرال المركزة المخففة مع أربعة ملليمترات من المتوسط DMEM كاملة, تحتوي على كاشف بوليبرين.
إعادة الخلايا إلى الحاضنة لمدة 18 ساعة. يجب اختبار البوليبرين في ظروف مختلفة لتحديد التركيز الفعال ، والذي عادة ما يكون في حدود 2 إلى 10 ملليغرام لكل ملليلتر. بعد 18 ساعة، استبدل الوسيط بـ 10 ملليلتر من DMEM بنسبة 10٪ FBS و أعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة.
ثم، الطامح مع مكبر مع حطام الخلية وإضافة DMEM جديدة تكملها 10٪ FBS و 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر من Puromycin. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة أخرى. ثم, تغيير المتوسطة مرة أخرى إلى DMEM جديدة تكملها 10٪ FBS وخمسة ميكروغرام لكل المليلتر Puromycin.
بعد حضانة أخرى لمدة 24 ساعة ، شطف GCSC المنضم مرتين مع خمسة ملليلتر من DPBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم. افصل الخلايا بميليلتر واحد من محلول تفكك الخلايا المدفأة قبل ذلك واحتضانها لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق عند 37 درجة مئوية. ثم، إضافة خمسة ملليلتر من الطازجة قبل warmed GCSC ثقافة كاملة متوسطة إلى تعليق الخلية.
الاستغناء عن ثلاثة ملليلترات من هذا التعليق في أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر للتبريد، وثلاثة ملليلترات أخرى في أنبوب آخر لالتحريض مع doxycycline. جهاز طرد مركزي كلا الأنابيب في 800 مرة G لمدة خمس دقائق. ثم, الطامح من أنبوب B وإعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من الطازجة قبل الدافئة GCSC ثقافة كاملة المتوسطة.
بذور عدد مناسب من الخلايا في طبق جديد بيتري 100 ملليمتر مع 10 ملليلتر من الطازجة قبل الدافئة GCSC ثقافة كاملة المتوسطة و 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر doxycycline. ثم، احتضان الطبق لمدة 48 ساعة. استخدم عداد الخلايا التلقائي لتحديد كثافة عينة من الخلايا سعة 10 ميكرولتر.
ثم، ضبط وحدة التخزين مع GCSC قبل warmed كامل ثقافة المتوسطة للحصول على تركيز 20،000 الخلايا القابلة للحياة لكل ملليلتر. الاستغناء 100 ميكروليتر من تعليق الخلية في كل بئر من جديد, مرفق منخفضة جدا 96 جيدا لوحة الثقافة. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
يجب أن يحدث تشكيل المجال في غضون ثلاثة إلى 10 أيام. صورة تكوين مجال الورم كل يومين. تم زرع الخلايا الجذعية لسرطان المعدة من غدية المعدة البشرية الأولية في وسط الثقافة الخالية من المصل.
بعد ستة أيام، توسعت الخلايا من الخلية المفردة مثل النمط الظاهري إلى المجالات الكبيرة. لتقييم وظيفة التكتل في GCSCs، تم استنساخ تسلسلات دبوس الشعر القصير ضد التكتل في متجه Tet-GV307-RFP-Puro. تم علاج الخلايا التي تنقلها مع ناقلات التعبير مع doxycycline لمدة 48 ساعة.
ثم تم التحقق من تعبير التكتل بواسطة لطخة غربية وتم تحديدها كمياً حسب قياس الكثافة. وجود doxycycline وضربة قاضية من التكتل في GCSCs منعت تكوين مجال الورم. في حين لم يلاحظ أي تثبيط لتشكيل مجال الورم في الخلايا التي تم تحويلها مع الضوابط SHRNA مخفوقة, مشيرا إلى أن doxycycline وحدها لا تمنع تكوين مجال الورم.
وتشير هذه النتائج إلى أنه بعد تكتل إسكات, GCSCs تنمو ببطء ولا يمكن أن تشكل مجالات الورم. وبناء على هذه البيانات، يلعب التكتل دوراً حاسماً في تعزيز نشاط التجديد الذاتي لـ GCSCs، مما يشير إلى أنه يمكن أن يكون هدفًا واعدًا للأدوية لقمع الخلايا الجذعية السرطانية في مرضى سرطان المعدة. يجب أن تكون مجالات الأورام هياكل مستديرة صلبة على خلايا فردية أو مجمعة ، لا ينبغي اعتبارها مجالات ورم.
ومع ذلك، قد لا تشكل بعض الخلايا الجذعية السرطانية هياكل نموذجية في مجال الأورام. يمكن اتباع هذا الإجراء مع طرق أخرى لفحص الخلايا الجذعية السرطانية لإمكانات متجددة في المختبر. على سبيل المثال، يمكن دراسة التعبير عن العلامات المرتبطة بالرّكة.
ويمكن توسيع نطاق البروتوكول لدراسة وظائف الجينات الحرجة في الخلايا الجذعية السرطانية مثل الجذعية على البقاء على قيد الحياة.
