يمكن استخدام هذه الطريقة الجديدة من الثقافات الكروية لدراسة الورم لتحليل وجود مجموعات مختلفة من الخلايا الجذعية السرطانية ويمكن أيضا تطبيقها بشكل جيد من خلال شاشة عالية لوضع أدوية جديدة. هذا هو نظام قوي ومتكرر مثقف لتوليد عدد كبير من كرويات متجانسة الحجم. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه الكرويات لدراسة الخلايا الجذعية السرطانية.
تم إعداد هذه الطريقة لدراسة بيولوجيا السرطان المزمن ولكن يمكن إعدادها بسهولة لدراسة أنواع السرطان الأخرى عن طريق تغيير ظروف الثقافة ثلاثية الأبعاد. تأكد من مشاهدة الفقاعات في الوسط ، وعدم تحريك اللوحة كثيرا أثناء تكوين الكرويات وتوخي الحذر عند حصاد الكرويات في مصفاة. تبدأ قبل معالجة آبار لوحة بئر 24 مع 500 لتر صغير من المضادة للالتزام حل الشطف لكل بئر.
بعد بضع ثوان الطرد المركزي لوحة في الدوار يتأرجح دلو وشطف كل بئر مع 2 ملليلتر من المتوسط القاعدية الدافئة. مراقبة لوحة تحت المجهر لضمان أن الفقاعات قد أزيلت تماما من الآبار الصغيرة. إذا لم يتم ملاحظة فقاعات، شطف الآبار مرة أخرى قبل إضافة ملليلتر واحد من دافئ DMEM مصفوفة غشاء الطابق السفلي المتوسطة إلى كل بئر.
للحث على تشكيل كروية، انظر التركيز المطلوب من خلايا كاكو-2 في طبقة أحادية 2D في طبق 10 سم في DMEM تكملها 10٪ FBS و 1٪ المضادات الحيوية. للثقافة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في جو رطب. عندما يتم التوصل إلى التقاء 80٪، وغسل الخلايا مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني قبل علاج الثقافة مع اثنين من ملليلتر من تريبسين-EDTA لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
عندما تكون الخلايا قد فصل تحييد تريبسين مع أربعة ملليلتر من DMEM كاملة. بعد العد، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة إنفاق لوحة في الحجم المناسب من DMEM الطابق السفلي مصفوفة مصفوفة متوسطة لتحقيق التركيز المطلوب من الخلايا في ملليلتر واحد من المتوسطة لكل بئر. إضافة ملليلتر واحد من الخلايا إلى كل بئر من لوحة بئر 24 المدفوعة مسبقا، تليها إضافة ملليلتر واحد من DMEM مصفوفة غشاء الطابق السفلي المتوسطة إلى كل بئر.
بعد البذر، على الفور الطرد المركزي لوحة واستخدام المجهر الخفيف للتحقق من أن الخلايا قد وزعت بالتساوي عبر الآبار الصغيرة. ثم ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 48 ساعة دون إزعاج الخلايا. لحصاد كرويدات، في نهاية الحضانة، واستخدام ماصة المصلية ونصف من supernatant في كل بئر لطرد بلطف كرويدات من آبارها الصغيرة.
عندما تم فصل جميع كرويدات استخدام ماصة لنقل بعناية الثقافات 3D من كل بئر إلى مصفاة 37 ميكرون عكسها على رأس أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. غسل كل بئر ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من المتوسط القاعدي قبل الحرب لكل غسل لجمع أي كرويدات المتبقية وإضافة هذه كرويدات إضافية إلى مصفاة. بعد غسل الماضي تحقق من لوحة تحت المجهر للتأكد من أن جميع كرويدات قد أزيلت من الآبار الصغيرة.
ثم عكس مصفاة على أنبوب 15 ملليلتر جديدة وغسل الجزء السفلي من مصفاة مع DMEM الطازجة مصفوفة غشاء الطابق السفلي المتوسطة لجمع كرويدات في الأنبوب. الكرويات ترتفع من 500 خلية تثبت الزيادة الأكثر تجانسا في الحجم مع مرور الوقت. مع 500 و 600 خلية لكل كروية تحديد أن يكون العدد الأمثل للخلايا التي يمكن تحقيق نمو جيد وانخفاض التباين.
إضافة مصفوفة غشاء الطابق السفلي يعزز نمو كروية والتجانس. في الثقافة على المدى الطويل، تظهر الخلايا كطبقات متعددة كثيفة في اليوم الثالث. في حين أن الخلايا المسطحة مرتبة في طبقات أحادية مرئية بوضوح في اليوم 10.
ومن المثير للاهتمام، يظهر التجويف داخل كرويدات من اليوم الخامس فصاعدا. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظت زيادة واضحة في الخلايا النووية المتكاثرة مستضد الخلايا إيجابية في اليومين الخامس والسابع الذي ينخفض بحلول اليوم 10. والمثير للدهشة، لوحظ Caspace تنشيط 3 في عدد قليل جدا من الخلايا في اليومين الثالث والخامس فقط.
في حين لوحظت مستويات عالية من التعبير بيتا كاتينين في كل نقطة زمنية. ويتضح من إمكانات كرويدات للتمييز في Anterosites من خلال الفوسفاتاز القلوية والأسرة الناقلة سولوت 2A5 التعبير ميرنا. بالإضافة إلى ذلك ، تعبر هذه الكرويات عن علامات الخلايا الجذعية السرطانية النموذجية وتستجيب للعلاج الكيميائي المركب الذي يدار بشكل روتيني لمرضى سرطان القولون والمستقيم.
لذا تتكون كرويات من مجموعات خلايا مختلفة. ثم يمكن استخدامها بشكل جيد لتحليل الاستجابات الخاصة بالخلايا للمحفزات مثل الانكسار وفي نهاية المطاف للاستجابات الدوائية.
