암 줄기 세포는 약물 내성에 암 재발 전이에 연루된다. 이 프로토콜은 암 줄기 세포에 있는 중요한 유전자의 기능을 조사하기 위한 능률적인 방법을 제공합니다. 조건부 녹다운 시스템과 적응된 구체 형성 분석법을 사용하여, 이 방법은 암 줄기 세포의 다른 모형에 있는 줄기 관련 유전자에 시험관 내 및 생체 내 기능에 공부하기 위하여 쉽게 적응됩니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 연구 조수 인 Yuting Li와 Xiangyu Tan입니다. 렌티바이러스 입자를 생성하기 위해 400만 293T 렌티바이러스 포장 세포를 100mm 페트리 접시에 넣고 10%의 FBS를 보충한 DMEM 10밀리리터를 섭취합니다. 세포가 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 하룻밤 동안 배양하여, 세포가 트랜스포메이션 당일 50~80%의 컨실류인지 확인합니다.
감소된 혈청 을 실온으로 가져오고 원고 의 방향에 따라 튜브 A와 B를 준비합니다. 튜브 A의 내용을 튜브 B.Mix에 잘 추가하고 실온에서 15 분 동안 튜브를 배양하여 지질 DNA 복합체를 준비합니다. 세포 배양 접시에서 배지 5 밀리리터를 제거합니다.
그런 다음 지질 DNA 복합체 5밀리리터를 세포 배양 접시에 넣고 현명하게 떨어뜨리고 부드럽게 접시를 소용돌이시다. 문화 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 조심스럽게 트랜스퍼션 매체를 제거하고 10%의 FBS로 보충된 사전 따뜻하게 된 DMEM의 10 밀리리터로 교체하십시오.
세포를 24시간 동안 배양합니다. 약 48 시간 후 형질, 슈퍼 나티바이러스를 포함하는 렌티 바이러스의 10 밀리리터를 수확하고 세포 파편을 제거하기 위해 0.45 마이크로 미터 부어 필터로 필터링. 모든 세포 배양 용기, 팁, 필터 및 주사기는 렌즈바이러스를 포함할 수 있으며 폐기 전에 10%의 표백제로 처리되어야 합니다.
정제된 상체를 멸균 용기에 옮기. 렌티-X 농축기와 부드러운 반전을 섞어드린다. 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 혼합물을 배양합니다.
다음 날, 원심분리는 섭씨 4도에서 45분 동안 1500배 G로 샘플을 원심분리합니다. 상체를 조심스럽게 제거하여 하단의 펠릿을 방해하지 않도록주의하십시오. 10%의 FBS로 보충된 DMEM의 1밀리리터에서 펠릿을 부드럽게 다시 중단하고 섭씨 영하 80도에 보관하십시오.
씨앗 6 백만 위 암 줄기 세포 또는 GCSC의 100 밀리 미터 페트리 접시에 DMEM의 10 밀리리터보충 10% FBS. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 세포를 배양합니다. 세포가 70 내지 80%의 인플루언서에 도달하면, 접시로부터 배지를 흡수하고 폴리브레인 시약을 포함하는 완전한 DMEM 배지4밀리미터로 희석된 농축 렌티바이러스 입자를 첨가한다.
세포를 인큐베이터에 18시간 동안 반품합니다. 폴리브레인은 밀리리터당 2~10밀리그램의 범위에서 효과적인 농도를 결정하기 위해 다른 조건에서 테스트해야 합니다. 18시간 후, 배지를 DMEM의 10밀리리터로 10%의 FBS로 교체하고 세포를 인큐베이터로 24시간 동안 되돌린다.
그런 다음, 셀 파편과 슈퍼 네티미터를 흡인하고 Puromycin의 밀리리터 당 10 %의 FBS와 2.5 마이크로 그램으로 보충 신선한 DMEM을 추가합니다. 세포를 24시간 동안 배양합니다. 그런 다음 10%의 FBS와 밀리리터 푸로마이신당 5마이크로그램으로 보충된 신선한 DMEM으로 배지를 다시 변경합니다.
또 다른 24 시간 인큐베이션 후, 칼슘과 마그네슘없이 DPBS의 5 밀리리터와 두 번 준수 GCSC를 헹구. 전온 된 세포 해리 용액의 1 밀리 리터로 세포를 분리하 고 섭씨 37도에서 2 ~ 3 분 동안 배양. 그런 다음, 셀 현탁액에 신선한 사전 따뜻하게 된 GCSC 완전 배양 배지의 5 밀리리터를 추가합니다.
이 서스펜션의 3밀리리터를 냉동 보존을 위해 15 밀리리터 원심분리기 튜브에 분배하고, 다른 3밀리리터를 독시사이클린 유도용 다른 튜브에 분배합니다. 원심 분리기 는 5 분 동안 800 배 G에서 두 튜브. 그런 다음, 튜브 B로부터 상체를 흡인하고 신선한 사전 따뜻워진 GCSC 완전 배양 배지의 1 밀리리터로 세포를 다시 중단한다.
신선한 사전 따뜻하게 된 GCSC 완전 배양 배지의 10 밀리리터와 밀리리터 독시 사이클린 당 2.5 마이크로 그램의 새로운 100 밀리미터 페트리 접시에 적절한 수의 세포를 시드. 그런 다음 48 시간 동안 요리를 배양하십시오. 자동화된 세포 카운터를 사용하여 세포의 10 마이크로리터 샘플의 밀도를 결정합니다.
이어서, 미리 따뜻워진 GCSC 완전 배양 배지로 부피를 조정하여 밀리리터당 20, 000의 생존 가능한 세포의 농도를 얻습니다. 셀 서스펜션100마이크로리터를 각각 의한 새로운 초저부착 96웰 배양판에 분배한다. 이산화탄소5%로 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.
구 형성은 3~10일 이내에 이루어져야 한다. 종양 구체 형성을 2일마다 이미지화합니다. 1차 인간 위암 줄기세포는 혈청 자유배양배지에서 배양되었다.
6 일 후, 세포는 표현형과 같은 단일 세포에서 큰 구체로 확장되었습니다. GCSCs에서 클러스터진의 기능을 평가하기 위해 클러스터린에 대한 짧은 헤어핀 RNA 서열은 Tet-GV307-RFP-Puro 벡터로 복제되었다. 발현 벡터와 함께 감염된 세포는 48시간 동안 독시사이클린으로 처리되었다.
그런 다음 클러스터진 발현은 서양 블롯에 의해 검증되고 밀도에 의해 정량화되었다. 독시사이클린의 존재와 GCSCs에서 클러스터진의 녹다운종양 구형 억제. 종양 구형형성의 억제는 스크램블 된 shRNA 대조군으로 변환된 세포에서 관찰되지 않았지만, 독시사이클린만으로는 종양 구형성을 억제하지 않았다는 것을 나타낸다.
이러한 결과는 클러스터린 침묵 후 GCSC가 천천히 성장하고 종양 구를 형성 할 수 없다는 것을 시사한다. 이 데이터를 바탕으로, 클러스터린은 위암 환자에서 암 줄기 세포를 억제하기위한 유망한 약물 표적이 될 수 있음을 나타내는 GCSC의 자기 재생 활동을 촉진하는 데 중요한 역할을한다. 종양 구체는 개별 또는 집계된 세포에 고체 둥근 구조이어야 하며 종양 구체로 간주되어서는 안 됩니다.
그러나, 몇몇 암 줄기세포는 전형적인 종양 구체 구조를 형성하지 않을 수 있다. 이 절차는 생체 외에서 재생 가능한 잠재력을 위해 암 줄기 세포를 검사하는 그밖 방법과 함께 따를 수 있습니다. 예를 들어, 줄기 관련 마커의 발현을 연구할 수 있다.
프로토콜은 생존에 줄기와 같은 암 줄기 세포에 있는 중요한 유전자의 기능을 연구하기 위하여 확장될 수 있습니다.
