يوضح هذا البروتوكول كيفية التحقق من إفراز الخلية باستخدام التصوير الحي بواسطة المجهر TOF ويوفر أدوات للكشف عن أحداث التجمعات أو المناطق ذات النشاط العالي. باستخدام هذا البروتوكول، يمكننا توليد الثقافات الخلية على الأسطح الصغيرة التي تطبيع انقسام الخلايا وبالتالي تسهيل نطاقات خاصة من الأحداث إفرازية. تفرز الخلايا مجموعة متنوعة من الجزيئات الكبيرة التي تلعب أدوارًا مهمة في تنظيم المناعة.
في السرطان، إفراز تحريرها يؤثر على الإفراج عن الإنزيمات البروتية التي تسهل الغزو. سوف يمكننا القياس الكمي للافراز من فهم أفضل إفراز المتدهورة في السرطان والعمليات الحيوية الأخرى مثل هذا العرض المستضد. على الرغم من أن لدينا التصوير والتحليل البروتوكول هو واضح ، فإنه يتطلب توليد خلايا واحدة التي تنتشر بشكل جيد على قطعة من micropattern.
في هذا الفيديو، سوف نوضح كيفية زراعة الخلايا على الأغطية الصغيرة وكيفية تصور وتحليل الأحداث السرية باستخدام الأدوات الإحصائية المكانية. لإعداد أغطية لmicropatterning، تنشيط الإيثانول تعقيم 25 ملليمتر الزجاج يغطي قطرها 25 تحت الضوء فوق البنفسجي العميق لمدة خمس دقائق. في حين يتم تنشيط الأغطية، إضافة واحد 30 قطرات ميكرولتر من البولي إيثيلين الكسب غير المشروع بولي إيثيلين جلايكول في coverlip على قطعة من فيلم البارافين داخل غرفة رطبة.
في نهاية التنشيط، ضع غطاء السطح النشط على السطح أسفل على قطرات وتغطية غرفة رطبة لمدة ساعة حضانة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وغسل الأغطية مرتين في الماء المقطر. في حين أن الأغطية هي التجفيف، وغسل قناع صور الكوارتز مرة واحدة مع الماء المقطر ومواحدة مرة مع الكحول.
جفف قناع الصورة مع تدفق الهواء المصفى وفضح قناع الصورة كروم المغلفة الجانب تصل إلى الضوء فوق البنفسجي العميق لمدة خمس دقائق. في نهاية الإضاءة، إضافة قطرة 10 ميكرولتر من الماء على الجانب المغلفة الكروم من كل قناع الصورة ووضع جانب البولي إيثيلين جلايكول من كل غطاء على كل قطرة ماء. بعد إزالة أي ماء زائد، ضع غطاءً للفيلم على الشرائح لتجنب الجفاف.
تعريض الجوانب المغلفة غير الكروم من أقنعة الصورة إلى ضوء فوق البنفسجي العميق لمدة خمس دقائق إضافية قبل إضافة المياه الزائدة إلى أقنعة الصورة لإزالة الأغطية. هذه الخطوة سوف تنتج بصمات micropattern على السطح. ثم احتضان الأغطية في محلول بروتين مصفوفة خارج الخلية على فيلم البارافين في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة تحت غطاء تدفق لارينار.
لبذات الخلايا على سطح micropattern المعدة، في نهاية الحضانة، ووضع الأغطية في الجانب المغناطيسي حامل غطاء micropattern حتى وإضافة نمط على الفور المتوسطة إلى الأغطية. بعد إضافة الختم، شلّس الغطاءات مع الجهاز المغناطيسي قبل ملء حامل الغطاء بنمط إضافي. ثم أغلق الحامل بغطاء زجاجي.
عندما تكون الخلايا جاهزة، إضافة 5 مرات 10 إلى 5 من الخلايا الظهارية الصباغ الشبكية الخالدة عبر العدوى إلى الأغطية واحتضان الخلايا في حامل لمدة 10 دقائق في الحاضنة ثقافة الخلية. في نهاية الحضانة، استخدم ماصة واحدة لpireate المتوسطة القديمة أثناء استخدام ماصة ثانية لغسل الخلايا خمس مرات مع المتوسطة الطازجة لكل غسل لإزالة الخلايا غير المرفقة وأية مصل البقر الجنين المتبقية. بعد الغسيل الأخير، ارجع الحامل إلى الحاضنة لمدة ثلاث ساعات للسماح بانتشار الخلية بالكامل.
لتصوير أحداث القذف، ضع حامل الغطاء تحت مجهر الانعكاس الداخلي الكلي، وابحث عن خلية تعبر عن VAMP7-pHluorin تنتشر بالكامل. تغيير زاوية الليزر حتى يتم الوصول إلى زاوية الانعكاس الداخلي الكلي الفلورية التي تسمح للتصور من الأحداث exocytosis VAMP7-pHluorin وتنفيذ عملية استحواذ لمدة خمس دقائق على تردد متوافق مع معدل التناضح والمقياس الزمني. للحصول على إحداثيات التناضح، افتح فيلم حدث الإزراق المكتسب في فيجي وحدد يدوياً أحداث الداء الطارد عن طريق ظهور إشارة ساطعة تنتشر إلى الخارج.
استخدام أداة نقطة للاحتفال مركز الحدث exocytosis واستخدام تحليل وقياس لقياس س و y الإحداثيات وكذلك الإحداثيات الزمنية. حفظ قياسات خلية واحدة في ملف نصي واحد. افتح الملف النصي في جدول بيانات وأزل كافة الأعمدة ما عدا الشريحة x و y-coordinate.
بعد ذلك، استخدم الأداة البيضاوية وقياس لقياس المركز وقطره والحصول على س و إحداثيات ص وقطر فيريت لكل خلية. حفظ قياسات كافة الخلايا في ملف نصي واحد. افتح الملف النصي في جدول البيانات وأزل كافة الإحداثيات سوى x و y وأعمدة قطر Feret.
ثم إضافة قياس نصف القطر لكل خلية، ثم الحصول على نصف القطر من قطر Feret لكل خلية. استخدم أداة الخط المستقيم لقياس سمك الحلقة الصغيرة لكل خلية. حفظ هذا القياس لكافة الخلايا في ملف نصي واحد، ثم تقسيم طول التصاق على نصف قطر الخلية لحساب طول التصاق تطبيع.
بالنسبة للتحليل المكاني لخلية واحدة، قم أولاً بتثبيت حزمة RStudio ثم قم بتحميل الحزمة في RStudio. تشغيل الحزمة مع وظيفة ESA. سيتم فتح واجهة مستخدم، ثم حدد الدليل لملفات TXT لمجموعة البيانات ودليل لمؤامرة الإخراج.
سيبدأ البرنامج النصي تلقائيًا وينجز التحليل، مع توفير ملفات PDF للمواقع المقابلة وملفات TXT التي تحتوي على النتائج الرقمية. داخل الخلية، يتم إخماد الأرض في التحقيق من قبل انخفاض عدد المواد الهية من lysosome، ولكن أثناء الخراج، pHluorin يبدأ في إصدار إشارة كما يزيد من pH بسبب إطلاق البروتون. تظهر إشارة pHluorin ذروة أثناء القذف الذي يمثل الإطلاق السريع للبروتونات الليفية ، يليه تسوس إشارة أسية يمثل الانتشار 2D للمسبار في غشاء البلازما.
عادة، transfect خلد الخلايا الظهارية مصطبغة شبكية العين البشرية توضح نشاط إفراز lysosomal الهامة مع متوسط معدل الظهارة من 0.28 هيرتز. فمن الممكن تصور 2D توزيع الزخراب بواسطة تقدير كثافة النواة للكشف عن الاختلافات في الكثافة المحلية. هناك ثلاثة انحرافات محتملة عن العشوائية المكانية الكاملة: التجميع أو التشتت أو خليط من التجميع والتشتت.
يمكن استخدام وظيفة ريبلي K لتقييم هذه الانحرافات. ملاحظة, أحداث القذف في منطقة غير لاصقة هي أيضا مجمعة تشير إلى أن جزيئات التصاق ليست الهياكل الوحيدة التي تحفز النقاط الساخنة في إفرازية في أغشية البلازما. رسم الرسم البياني لأحداث exocytosis وفقا لم ومعامل لخلية تمثيلية يكشف عن ذروة حول الحدود بين المناطق اللاصقة وغير لاصقة.
التحليل المقترن يوضح أن كثافة السطح أقل في منطقة الالتصاق مما هي عليه في منطقة عدم الالتصاق، يحتمل أن يرجع ذلك إلى الانخفاض القوي في إفرازات في محيط الخلية. الجمع بين التصاق الخلية على micropatterns مع التحليل الإحصائي يسهل القدرة على تحديد كيفية تنظيم العمليات الخلوية المعقدة مثل إفراز في الفضاء. هناك حاجة إلى مزيد من العمل في المستقبل لتحديد الآلية الجزيئية التي تكمن وراء تجميع النشاط السري.
