وسيسمح برنامج الكشف والتحليل الآلي للتكسير للمستخدم بالكشف تلقائيا عن الأحداث الإكسيسية وتسلسلات صور TIRF للفلوروفور الحساسة ل الرقم الحموضة. كما أنه سيقوم تلقائيا بإخراج ميزات الإفرازات مثل التوزيع المكاني أو التردد ، بالإضافة إلى الخصائص الفردية للأحداث الإكسوسيتيكية ، مثل نصف العمر أو التغيير في الفلورسينس على الخلفية. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تضمين خيار لتصنيف الأحداث exocytic إلى أربعة أنماط من exocytosis، وصفت سابقا في الأدب.
من أجل استخدام برنامج الكشف والتحليل التلقائي ل Exocytosis ، أولا ، انقر فوق زر البحث عن مجموعة البيانات ، وستنتقل إلى مكان إيداع بياناتك ، وسترغب في وضع مجلد يسمى البيانات الأولية. ملفات البيانات الخاصة بك تلقائيا ملء القائمة هنا، ويمكنك الحصول على أي عدد من ملفات البيانات في هذا المجلد. بعد ذلك، ستحتاج إلى اختيار دليل يتم إيداع ملفات التحليل الخاصة بك له.
هنا ، لقد اخترت دليل يسمى الاختبار. ستحتاج أيضا إلى ملء معدل الإطار لصورك بالإضافة إلى حجم البكسل. هنا معدلات الإطار بلدي هي مائة مللي ثانية لكل إطار ، وحجم بكسل بلدي هو ثمانية نانومتر.
وأخيرا، سوف تحتاج إلى ملفات قناع من أجل تشغيل الكشف الآلي وتحليل برنامج Exocytosis. يمكنك استخدام زر صانع قناع المضمنة من أجل إنشاء ملفات قناع تلقائيا من ملفات البيانات الخاصة بك. مؤشر التشغيل سوف يتحول إلى اللون الأصفر ثم يعود إلى اللون الأخضر عند الانتهاء من تشغيل صانع القناع.
سيتم إيداع القناع في مجلد جديد يسمى ملفات القناع في الدليل الذي اخترته. وملاحظة، ملفات قناع سيتم تلقائيا ملء القائمة هنا. سوف تحتاج إلى التحقق من أن ملفات القناع الخاصة بك يتم إجراؤها بشكل مناسب لملفات البيانات الخاصة بك، ويمكنك القيام بذلك عن طريق تمييز أي من ملفات البيانات في القائمة، وكذلك ملف القناع المطابق.
سيظهر الإطار الأول لملف البيانات الخاص بك وسيظهر ملف القناع المحدد أيضا. هنا. يمكننا أن نرى أن ملفات قناع لدينا هي مناسبة للتحليل في متناول اليد. قد يتم أيضا توفير ملفات القناع من قبل المستخدم بشكل منفصل.
عندما يرغب المرء في إنشاء ملف قناع من ملف بيانات حالي نوصي باستخدام Image J.In للقيام بذلك ، افتح الصورة في Image J التي ترغب في إنشاء ملف قناع منها. يمكنك بعد ذلك استخدام أداة تحديد المضلع للبدء في إنشاء ملف قناع حولها عن طريق النقر حول حافة الخلية. عند إكمال القناع، انقر نقرا مزدوجا للاتصال بالمضلع بأكمله.
بمجرد الانتهاء من ذلك، سوف يتوجه إلى تحرير، واختيار وإنشاء قناع. سيتم إنشاء قناع مقلوب. ستحتاج إلى حفظ ملف القناع هذا باستخدام نفس اسم ملف البيانات متبوعا _mask_file.
الآن، إذا قمت بتوفير ملفات قناع مخصصة خاصة بك، فمن المهم السماح لبرنامج الكشف الآلي بمعرفة مكان ملفات القناع هذه. للقيام بذلك سوف انقر فوق الزر العثور على ملفات قناع، وانتقل إلى الدليل مع ملفات القناع الخاص بك في ذلك. ملفات قناع جديد ثم ملء القائمة هنا.
من المهم أن يكون لديك قناع لكل ملف بيانات واحد قبل أن يتم تشغيل التحليل. الآن، بمجرد تحميل مجموعة البيانات الخاصة بك، وملفات القناع، ومعدل الإطار وحجم البكسل المعدل بشكل صحيح، ودليل مختار، يمكنك أخيرا تحديد ما إذا كنت تريد تضمين التصنيف كجزء من تحليلك. إذا قمت بتبديل زر التصنيف، بالإضافة إلى الكشف عن الأحداث exocytic، سيتم تصنيف كل حدث exocytic إلى واحدة من أربع فئات.
بمجرد أن تقرر الطريقة التي سيتم بها تشغيل التحليل الخاص بك ، يمكنك بعد ذلك بدء التحليل بالنقر على زر التحليل. سيتحول مؤشر التشغيل إلى اللون الأصفر للإشارة إلى أن التحليل جار وسيعود إلى اللون الأخضر عند الانتهاء من تحليلك. بمجرد اكتمال التحليل، كما هو مبين في مؤشر التشغيل الخاص بك تغيير من الأصفر إلى الأخضر، ستلاحظ أن مجلد ملفات بيانات جديدة قد ظهرت داخل الدليل الذي اخترته.
ضمن مجلد ملفات البيانات، ستجد ملفات تحليل مطابقة لكل مجموعة صور في تشغيل التحليل. بالإضافة إلى ذلك، يوجد هنا ملف إحصائيات خلية يحتوي على معلومات موجزة مثل تكرار الإصابة بالنضح لكل مجموعة من مجموعات الصور. لكل مجموعة صور، لديك ملف تتبعات الفلورسنت، الذي يحتوي على معلومات حول موضع X، وموضع Y ورقم الإطار حيث تحدث الأحداث exocytic.
بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم متوسط الفلورسينس في منطقة ذات أهمية حول كل حدث خارجي قبل وأثناء وبعد الإفراز. وبالإضافة إلى ذلك، هناك أيضا ملف تتبع، الذي يحتوي على معلومات مماثلة من المواقع X، Y والزمنية. ومع ذلك، إذا تم تحديد خانة الاختيار تصنيف بالإضافة إلى ذلك، سيكون هناك أربعة أعمدة إضافية، والتي تشير إلى احتمال الحدث exocytic تنتمي إلى واحدة من أربع فئات.
إما الانصهار الحويكل الكامل لحظيا، الانصهار الحويكل الكامل تأخر، قبلة وتشغيل لحظية، أو قبلة وتشغيل تأخر. ينتمي حدث exocytic إلى إحدى الفئات الأربع إذا كان أكبر من 0.5 وهو الاحتمال الأعلى ضمن الفئات الأربع التي تحكمها. في هذه الحالة، الحدث exocytic الأول هنا ينتمي إلى فئة الانصهار الحويكل الكامل لحظية، كما هو أعلى عدد فوق الفئات الأربع وأنها أكبر من 0.5.
بالإضافة إلى ذلك ، هناك عدد من ملفات الميزات الأخرى لكل مجموعة صور ، والتي يتم استخدامها أثناء تصنيف التناضح وقد تكون ذات فائدة لمزيد من التحليل. وأخيرا، إذا كنا نريد استخدام تحليل ريبلي K من أجل الكشف عن التنظيم المكاني والزماني للتكسيس، سنبدأ أولا بتقسيم ملف القناع الخاص بنا إلى ملف قناع neurite وملف قناع سوما. سنقوم بذلك عن طريق فتح قناعنا أولا في Image J.We سنرغب في استخدام منتقي الألوان من أجل تحديد بكسل الخلفية.
وبهذه الطريقة، عندما نقوم بتعبئة ملف القناع، فهي القيمة الصحيحة. بعد ذلك سنستخدم أداة اختيار المضلع ونحدد المنطقة الجسدية. الآن هذا يتطلب قليلا من ذاتية، واتخاذ القرار اليدوي.
نقترح إهليلجي خشن. بمجرد الانتهاء من ذلك ، ستذهب بعد ذلك إلى التعديل والاختيار وإنشاء القناع. وأخيرا، سوف يعود إلى ملف قناع الأصلي واستخدام تحرير وملء من أجل ملء سوما، والآن لدينا neurite منفصلة وقناع سوما الملف، والتي سوف ثم حفظ.
مرة واحدة كنت قد حفظ ملف الخاص بك neurite منفصلة وقناع سوما، وهنا، ولدي ذلك كملف قناع التأكيد على neur لنيوريت ويؤكد سوما، سوف نأتي إلى MATLAB وفتح ملف شبكة 2D neurite MATLAB. هنا، سوف نتنقل في المجلد الحالي إلى دليلنا حيث قمنا بإيداع جميع بيانات التحليل الخاصة بنا. بمجرد أن نفعل ذلك، سنكون قد غيرنا مسار اسم القناع إلى ملف القناع الجديد الذي هو neurite.
حتى في هذه الحالة، لدي ملف قناع neurite بلدي تحت مجلد ملفات قناع. سنقوم بعد ذلك بتغيير اسم ملف CSV إلى مكان وجود ملف آثار الفلورسنت الخاص بنا. في هذه الحالة، فإنه لا يزال في مجلد ملفات البيانات، وهكذا مائلة ملفات البيانات واسم ملف تتبعات الفلورسنت CSV.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، يمكنك بعد ذلك ضرب تشغيل. هذا ثم إنشاء نسخة هيكل عظمي من ملف قناع neurite وإيداعه كملف CSV تحت قناع الملفات المجلد، والتي يمكننا أن نرى هنا. المقبل سنقوم بإنشاء ملف CSV للسما كذلك.
للقيام بذلك، افتح ملف منشئ قناع CSV. ستحتاج إلى وضع قناع سوما واسم لملف CSV المراد إنشاؤه. هنا ذهبت فقط إلى الأمام واستخدمت نفس اسم الملف الدقيق ، فقط مع ملحق CSV نقطة.
ضرب تشغيل، وسترى أن تم إنشاء ملف سوما CSV جديدة جنبا إلى جنب مع neurite. مرة واحدة لقد أنشأنا ملفات CSV لكل من قناع neurite وقناع سوما، يمكننا تشغيل تحليل ريبلي K. للقيام بذلك سنقوم التنقل إلى R ستوديو وفتح ملف R تحليل ريبلي K.
هناك نوعان من المتغيرات الرئيسية هنا أن تولي اهتماما ل, قناع الخلايا العصبية ونقاط البيانات العصبية. سوف قناع الخلايا العصبية تشير إلى أيهما قناع الملفات التي ترغب في تشغيل. في هذه الحالة، أنا أول تشغيل ملفات قناع سوما.
سوف تحتاج إلى تشغيل كافة ملفات قناع سوما بشكل منفصل عن كافة ملفات قناع neurite. هنا ، لدي اثنين من الخلايا العصبية ، والتي سوف تستخدم لهذا التحليل. ومع ذلك ، يمكنك استخدام ما تشاء لتحليل ريبلي K ، ستحتاج فقط إلى نسخ ولصق هذا الرمز لقناع الخلايا العصبية وتغيير المتغير إلى ثلاثة ، وما بعده.
المتغير الثاني هو نقاط بيانات الخلايا العصبية. هنا تريد أن تشير إلى الملف الذي تم إنشاؤه بواسطة الميزات الخاصة بك كل ملف R المستخرجة. الآن كان اسمه الألغام احصائيات الانصهار ، وذلك هو ما يقرأ هنا.
كما ذكر، لدي ملف قناع سوما الثاني والخلايا العصبية، والتي يجري تحليلها جنبا إلى جنب حتى نتمكن من تجميع K ريبلي معا. بمجرد تغيير هذه المسارات إلى المسار الصحيح، ثم سيتم استخدام التعليمات البرمجية، تشغيل المنطقة، وتشغيل كافة. بعد اكتمال التشغيل، سيتم إنشاء العديد من المؤامرات، بما في ذلك قيم ريبلي K المجمعة، بالإضافة إلى قطع الكثافة.
ويمكن حفظ هذه عن طريق الذهاب إلى تصدير وحفظ صورة واختيار تنسيق الصورة المناسبة ، والدليل ، واسم الملف ، وأخيرا ضرب حفظ. هنا نرى نتائج تمثيلية من 12 الخلايا العصبية القشرية مورين التعبير عن تنفيس للفلور في الصورة في يومين في المختبر باستخدام المجهر TIRF. في A، نرى تواتر التناضح مقسوما على الطبقة.
هنا يمكننا أن نرى أن الانصهار الحويكل الكامل يحدث بشكل متكرر أكثر من الطبقات الأخرى. في B ، يمكننا أن نرى توزيع الوضع ، مما يؤكد أن الانصهار الحويكل الكامل لحظيا يشكل أكثر من نصف جميع الأحداث. في C نحدد التوزيع المكاني للتكشير كخريطة حرارية.
يمكننا أن نرى أن غالبية الأحداث exocytic تتجمع في نقطة ساخنة بالقرب من سوما، وكذلك في نهايات البعيدة من neurites. في D يمكننا تحديد أن الأحداث exocytic تتجمع إحصائيا بشكل ملحوظ، وأن حجم هذه المجموعات تتراوح من نصف ميكرون إلى ميكرون واحد في الحجم. استخدام برنامج التحليل الآلي لتحديد وتحليل الأحداث الخارجية بشكل صحيح بطريقة غير متحيزة يزيد من كفاءة التحليل ، ويحسن من القابلية للاستنساخ والصرامة.
لضمان دقة الكشف، من المهم الحفاظ على إشارة عالية إلى الضوضاء أثناء التصوير. يتطلب التقاط الأحداث الإفرازية أو غيرها من الأحداث العابرة الحساسة لhH تردد تصويري بسرعة كافية لالتقاط جميع الأحداث وتحسين التقديرات مثل نصف العمر أو ذروة التغير في الفلورسينس. لقد أثبتنا أن هذا البرنامج لا يعمل فقط لالتقاط بدقة مضان حساسة لhH في تطوير الخلايا العصبية، ولكن أنواع الخلايا الأخرى كذلك.
ومع ذلك، إذا كان استخدام نوع خلية أخرى، من المهم التحقق من وجود اختلافات في الدقة، بسبب السلوكيات المتميزة للأحداث عابرة في أنواع الخلايا الأخرى. وقد استخدم هذا التصنيف فقط في تطوير الخلايا العصبية حتى الآن. وبالفعل نحن لا نعرف أن هذه العمليات موجودة في أنواع الخلايا الأخرى أو في وقت لاحق نقاط وقت النمو في الخلايا العصبية.
