هذا البروتوكول سوف تظهر كيف يمكن أن تكون البذور متمايزة مستحثة الخلايا الجذعية متعددة القدرات على جهاز على رقاقة لتوليد الإنسان تماما، شخصية، حاجز الدم في الدماغ microfluidic، والتي يمكن استخدامها للتنبؤ نفاذية المخدرات الجهاز العصبي المركزي ودراسة الاضطرابات العصبية. باستخدام الجهاز على رقاقة المتاحة تجاريا، وسوف نبين كيف يمكن لأي مختبر الموجه بيولوجيا استخدام هذه التكنولوجيا لتوليد شخصية، microfluidic حاجز الدم في الدماغ على رقاقة. وتشير الأدلة المتراكمة إلى أن BBB يلعب دورا في الأمراض العصبية من خلال توليد رقائق BBB الشخصية المستمدة من iPSCs من الأفراد الذين يعانون من مرض عصبي وراثي.
وسيكون من الممكن دراسة دور BBB في الصحة والمرض. ويمكن أن تكون هذه الطريقة مفيدة أيضا لشركات الأدوية، التي يمكن أن تستخدم هذه منصة BBB الإنسان لفحص لpenetrability من الأدوية العصبية مرشح في الدماغ البشري. إن تطبيق التكنولوجيات الخاصة بالأعضاء على الشريحة يتطلب عادة مهارات هندسية متخصصة.
باستخدام منصات متاحة تجاريا تمكن تطبيق هذه التكنولوجيا في أي مختبر الموجهة بيولوجيا. للبدء، جلب الطبق الذي يحتوي على رقائق أعدت لمجلس الوزراء السلامة البيولوجية. باستخدام ماصة P200، وغسل بلطف كلا القناتين عن طريق إضافة 200 ميكرولترات من التمايز العصبي المتوسطة في مدخل وسحب السائل من منفذ.
تجنب الاتصال مع الموانئ، وpirpirate بعناية قطرات وسائل الإعلام الزائدة من سطح الشريحة. يهيج بلطف تعليق الخلية لضمان تعليق الخلية متجانسة. لزرع الخلايا السلف العصبي المشتقة من iPSC في القناة العليا لتوليد جانب الدماغ ، أضف نصيحة P200 تحتوي على 30 إلى 100 ميكرولترات من تعليق الخلايا بتركيز مرة واحدة 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر إلى مدخل القناة العلوي ، والإفراج بلطف عن الطرف من الماصة.
خذ ماصة P200 فارغة، والاكتئاب المكبس، وإدراج في منفذ القناة العلوي، وسحب بعناية تعليق خلية واحدة من خلال طرف. نقل رقاقة إلى المجهر للتحقق من كثافة البذر والتوزيع المتجانس للخلايا داخل القناة العليا. بعد التأكد من كثافة الخلية في تغطية 20٪، على الفور وضع رقائق في الحاضنة لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية.
بعد ذلك، وغسل الخلايا التي لا نعلق بإضافة تمايز عصبي جديد المتوسطة في مدخل وسحب السائل عن طريق ماصة من مأخذ. إبقاء الخلايا في ظل ظروف ثابتة في 37 درجة مئوية مع استبدال متوسط التمايز العصبي اليومي. بعد أن تعلق INPCs أو في يوم لاحق بعد البذر ، أحضر الطبق الذي يحتوي على رقائق جاهزة إلى مجلس الوزراء السلامة الحيوية.
غسل بلطف القناة السفلية مع 200 ميكرولترات من وسط الخلية البطانية. تجنب الاتصال مع الموانئ، قطرات التعرق بعناية من فائض متوسط الخلية ال endothelial من سطح الشريحة، مع التأكد من ترك المتوسطة في كلتا القناتين. يهيج بلطف تعليق الخلية لضمان تعليق الخلية متجانسة.
باستخدام ماصة P200، رسم ما يصل 30 إلى 100 ميكرولترات من الدماغ المشتقة من iPSC تعليق الخلايا البطانية الدقيقة الأوعية الدموية بتركيز 14 إلى 20 مرة 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر، ووضع الطرف في القناة السفلية مدخل. الخطوة الأكثر أهمية لتحقيق خصائص الحاجز الوظيفي هو بذر خلايا البطانية الأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ. من الأهمية بمكان أن الخلايا البذور في الكثافة المناسبة لتجنب تشكيل فقاعة للتحقق من التوزيع متجانسة داخل رقاقة الجهاز.
اِكْدُ المكبس على ماصة P200 مع طرف فارغ، إدراج في منفذ القناة السفلي، والإفراج ببطء المكبس ماصة لسحب بعناية تعليق خلية واحدة من خلال القناة السفلي. استلهمي تعليق الخلايا الزائدة من سطح الرقاقة. تجنب الاتصال المباشر مع منافذ المدخل والمنفذ لضمان عدم ستنشق أي تعليق الخلية من القنوات.
نقل رقاقة إلى المجهر للتحقق من كثافة البذر. يتم ملء القناة السفلية مع الخلايا مع عدم وجود فجوات ملحوظة في ما بين. بعد التأكد من كثافة الخلايا الصحيحة، بذور الخلايا في رقائق المتبقية.
لإرفاق الخلايا على الغشاء المسامي، الذي يقع على قمة القناة السفلية، عكس كل رقاقة، والسماح لهم بقية في مهد رقاقة. ضع خزانًا صغيرًا يحتوي على DPBS معقمة داخل الطبق 150 ملليمترًا لتوفير الرطوبة للخلايا. احتضان الرقائق في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات تقريبا أو حتى الخلايا في القناة السفلية قد تعلق.
مرة واحدة في الدماغ المشتقة من iPSC الخلايا البطانية الدقيقة الأوعية الدموية قد تعلق، الوجه رقائق العودة إلى وضع مستقيم للسماح مرفق الخلية إلى الجزء السفلي من القناة السفلية. 48 ساعة بعد البذر من الخلايا البطانية الدقيقة الدماغ المشتقة من iPSC، توازن درجة حرارة وسط الخلية البطانية عن طريق الاحترار في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم، degas المتوسطة عن طريق الحضانة تحت نظام الترشيح التي يحركها فراغ لمدة 15 دقيقة.
بعد ذلك، قم بتعقيم السطح الخارجي للتعبئة والتغليف و الصواني المحمولة مع 70٪ من الإيثانول، مسح، ونقلها إلى مجلس الوزراء السلامة الحيوية. افتح العبوة، وضع الوحدات النمطية في الدرج توجهها مع الخزانات باتجاه الجزء الخلفي من الدرج. Pipette ثلاثة ملليلتر من ما قبل التوازن، وسائل الإعلام الدافئة إلى كل خزان مدخل.
إضافة ثقافة الخلية البطانية المتوسطة إلى خزان مدخل القناة السفلية والتمايز العصبي المتوسطة إلى خزان مدخل القناة العليا من القناة العليا. ثم، ماصة 300 ميكرولترات من وسائل الإعلام قبل التوازن، دافئة إلى كل خزان منفذ، مباشرة على كل منفذ منفذ. ضع ما يصل إلى ست وحدات محمولة على كل صينية.
جلب الصواني إلى الحاضنة، والانزلاق تماما في وحدة الثقافة مع مقبض علبة تواجه الخارج. حدد وتشغيل دورة رئيس الوزراء على وحدة الثقافة. أغلق باب الحاضنة، واسمح للوحدة النمطية للثقافة بـ Prime الوحدات المحمولة لمدة دقيقة واحدة.
يتم إكمال دورة فتيلة عندما يقرأ شريط المعلومات جاهزة. قم بإزالة الدرج من وحدة الثقافة، واحضره إلى خزانة السلامة الحيوية. فحص الجانب السفلي من كل وحدة محمولة في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية للتحقق من أن الوحدات المحمولة تم بنجاح.
ابحث عن وجود قطرات صغيرة في جميع المنافذ الأربعة. إذا لم تظهر أي وحدة محمولة قطرات، أعد تشغيل دورة رئيس الوزراء على تلك الوحدات النمطية. إذا كان أي وسائط يقطر على الدرج، والذي يحدث في كثير من الأحيان من منافذ منفذ، تنظيف علبة مع 70٪ الإيثانول.
بعد ذلك، قم بغسل كل قناتي كل شريحة بوسيلة ثقافة دافئة ومُتَحدَّدة لل الخلايا لإزالة أي فقاعات محتملة في القناة، ووضع قطرات صغيرة من الوسائط على الجزء العلوي من كل مدخل ومنفذ منفذ. أدخل الرقائق مع حاملات في الوحدات المحمولة، ووضع ما يصل إلى ستة على كل صينية. أدخل الصواني في الوحدة النمطية للثقافة.
قم ببرمجة شروط ثقافة شريحة الجهاز المناسبة، مثل معدل التدفق والتمدد، على وحدة الثقافة. بمجرد اكتمال دورة التنظيم ، والتي تستغرق حوالي ساعتين ، تبدأ الشروط المبرمجة. بعد ذلك، وحدة ثقافة يبدأ تدفق في شروط ثقافة رقاقة الجهاز مسبقا.
الكيمياء المناعية على رقاقة حاجز الدم في الدماغ المستندة إلى iPSC سبعة أيام بعد البذر يظهر مجالات EZ متفاوتة في مجموعة خلايا عصبية مختلطة في القناة الجانبية للدماغ العلوي، بما في ذلك S100 بيتا إيجابية الفلكية، نستين إيجابية الخلايا السلف العصبية، فضلا عن GFAP-الخلايا الفلكية الإيجابية، وبيتا الثالث tubulin-الخلايا العصبية الإيجابية. IPSC المستمدة من خلايا البطاخلية البطانية الدقيقة الأوعية الدموية المشتقة من IPSC المصنفة في قناة الجانب الدم السفلي أعرب GLUT-1 وPECAM-1. تقييم نفاذية حاجز حاجز الدم في الدماغ يوضح أن رقاقة الجهاز بذر مع الخلايا البطانية الدقيقة الأوعية الدموية الدقيقة الدماغ المشتقة من iPSC ومجالات EZ كان لها حاجز ضيق مقارنة مع رقائق الجهاز بذر مع الخلايا البطانية البطانية الأوعية الدموية الدقيقة المشتقة من iPSC وحدها.
لم تظهر رقائق الأعضاء المصنفة مع مجالات EZ وحدها أي خصائص الحاجز. من المعالجة السطحية الأولية للقناة إلى التبديل المتوسط كل يوم ، تجنب تشكيل الفقاعة في القناة. في جميع مراحل الخطوة في البروتوكول الذي يجب إدخال مُشفر التنشيط السطحي أو المصفوفة خارج الخلية أو الوسيطة المحتوية على الخلايا عبر القنوات، من المهم للغاية التحقق من عدم وجود فقاعة بعناية.
يمكن إجراء فحص نفاذية لتقييم penetrability الدماغ البشري من الأدوية المرشحة. ويمكن أن يفيد هذا النهج في اختبار العلاجات المحتملة. تطبيق رقاقة BBB المستندة إلى iPSC يسمح بدراسة دور BBB في الأمراض العصبية المختلفة.
في المستقبل، قد تكون هذه المنصة مفيدة لتطبيقات الطب التنبؤية والشخصية.
