بطانة الرحم هو الأنسجة التي تتغير كل شهر استجابة للهرمونات. يمكن أن يؤدي اختلال التوازن الهرموني إلى منع تعلق الأجنة ويسبب أمراضًا مثل السرطان. بروتوكولنا يعيد بناء بطانة الرحم بحيث يمكن دراستها خارج جسم المرأة بطريقة فسيولوجية.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يوفر بنية ثلاثية الأبعاد من الخلايا التي تتألف من نوعين من الخلايا المستجيبة للهرمونات ، وخلايا الظهارية والستروما التي تنظم وتتصرف بشكل خاص كما تفعل في الجسم. منذ organoids يمكن أن تحاكي أفضل سلوك الأنسجة، فإنها يمكن أن تستخدم في نهاية المطاف لاختبار المخدرات المختلفة. يمكن استخدام الأعضاء بطانة الرحم لدراسة الآثار المباشرة لعوامل الخطر المعروفة حاليا للسرطان، بما في ذلك السمنة ومتلازمة المبيض المتعدد الكيسات.
تؤكد العضيات على أهمية أعمال الباراكرين بين نوعين من الخلايا. من المهم البدء بكمية كافية من الأنسجة. يمكن الحصول على كثافة الحق من الخلايا الظهارية والسترومال تكون خادعة.
أيضا ، و organoids صغيرة جدا ، ويمكن أن يكون من الصعب تصور مع تلطيخ IHC. التصور من هذا الإجراء مهم لأن هناك بعض الخطوات التي سوف يكون من الأسهل بكثير لفهم بعد رؤيتها. وتشمل هذه الحصول على طبقة الأنسجة الصحيحة من الرحم، والحصول على الكثافة الصحيحة للخلايا إلى الجمع، وبذر قوالب agarose.
قبل بدء عزل الخلية، يلقي وتكاوز 1.5٪ agarose القوالب الصغيرة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لإيواء organoids. في خزانة السلامة البيولوجية، استخدم تقنيات معقمة لإعداد محلول إنزيم عند 37 درجة مئوية وتصفية معقمة الحل باستخدام مرشح حقنة ميكرومتر 0.2 في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. باستخدام مشرط، كشط قبالة بطانة الرحم من الخزعات الرحمية و mince الأنسجة إلى قطع صغيرة جدا.
ضع الأنسجة المفرومة الطازجة في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر يحتوي على محلول الإنزيم. أغلق الغطاء ولف الجزء العلوي من الأنبوب بـ فيلم شمع لمنع التلوث. ضع الأنبوب في حمام مائي أو حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز بلطف.
بعد هذا، كومة مصفاة خلية 100 ميكرون على رأس مصفاة خلية 20 ميكرون على أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. تصفية الحل من خلال اثنين من مصافي. شطف أنبوب مخروطي 15 ملليلتر مع HBSS ووضع هذا الغسيل من خلال مصفاة لضمان أن يتم جمع جميع الخلايا.
ثم، عكس مصفاة الخلايا 20 ميكرون على أنبوب مخروطي جديد 50 ملليلتر وغسل الخلايا الظهارية قبالة مصفاة مع 20 ملليلتر من وسائل الإعلام العضوية تكمل مع 1٪ البنسلين وstreptomycin. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب المخروطية في 500 G لمدة خمس دقائق. للخلايا السترومال التي تم جمعها، وإزالة عظمى و resuspend بيليه في 10 ملليلتر من خلايا الدم الحمراء العازلة.
احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي هذه الخلايا في 500 G لمدة خمس دقائق. إزالة عظمى و resuspend بيليه مع 200 إلى 300 ميكرولترات من وسائل الإعلام organoid.
للخلايا الظهارية التي تم جمعها، وإزالة فائقة و resuspend بيليه في 100 ميكرولترات من وسائل الإعلام organoid. بعد توازن قوالب agarose 1.5٪، وإزالة الوسائط العضوية على السطح الخارجي لقوالب agarose وإمالة لوحة ثقافة الأنسجة بحيث المتوسطة من خلية بذور غرفة من أطباق agarose يمكن أيضا أن تتم إزالتها بعناية. عرض تعليق الخلايا الظهارية والسترومال تحت المجهر وإضافة المزيد من الوسائط العضوية إلى التعليقات، والتأكد من إضافة فقط 100 ميكرولترات في وقت واحد بحيث تعليق متساو تقريبا في الكثافة.
ثم الجمع بين جزء واحد من الخلايا التهيّم مع ثلاثة أجزاء من الخلايا الظهارية من حيث الحجم. Pipette 50 ميكرولترات من تعليق الخلية مجتمعة في غرفة البذر الخلية من قالب agarose. مرة واحدة يتم تعبئة قوالب agarose مع الخلايا، إضافة بعناية 400 ميكرولترات من وسائل الإعلام العضوية الطازجة في آبار لوحة 24-جيدا.
احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون، والتأكد من تغيير المتوسطة كل يوم الثاني مع 500 ميكرولترات من وسائل الإعلام organoid. بعد سبعة أيام، تغيير المتوسطة إلى واحدة التي تستكمل مع إستراديول نانومولر 0.1 و 0.8 نانومولر التستوستيرون لتعزيز تنظيم الخلايا الظهارية والسترومال. أولا ، حل 1.5 ٪ agarose في برنامج تلفزيوني عن طريق الغليان.
ضع الأنغروز السائل في منقار من الماء الساخن واسمح له بأن يبرد إلى ما يقرب من 50 درجة مئوية. تحت مجهر تشريح، إمالة لوحة 24 جيدا والماصة بعناية من المتوسطة من خارج قالب agarose. ثم الماصات بعناية من المتوسطة من الجزء الداخلي من قالب agarose لتجنب تعطيل organoids.
إضافة بعناية بين 70 و 75 ميكرولترات من الحارة، 1.5٪ agarose في غرفة طبق agarose، مع الحرص على عدم إزعاج organoids. دع اللوحة تبرد عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. بعد هذا، إضافة 4٪ شبهformaldehyde في كل بئر من لوحة 24-جيدا وإصلاح كامل مختومة agarose العفن بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.
في اليوم التالي، تخزين لوحة في 70٪ الإيثانول في أربع درجات مئوية حتى جاهزة لمعالجة لالبارافين تضمين. لبدء عزل الحمض النووي الريبي، عرض لوحة تحت مجهر تشريح. إمالة لوحة والميصة بعناية من المتوسطة من غرفة قالب agarose.
بقوة ماصة واحدة ملليلتر من المتوسطة العضوية الطازجة مباشرة في قالب agarose بحيث يتم مسح organoids من microwells، مع الحرص على عدم خلق فقاعات كثيرة جدا. كرر هذه العملية الأنابيب قوية مرة واحدة باستخدام نفس المتوسطة. بعد ذلك، جمع كل من المتوسطة التي تحتوي على organoids.
جهاز طرد مركزي في 500 G لجمع organoids، والشروع في استخراج الحمض النووي الريبي. في هذه الدراسة ، يتم إنشاء الأجهزة العضوية endometrial البشرية التي تتكون من الخلايا الظهارية والمائية من بطانة الرحم دون استخدام مواد سقالة خارجية. للمعالجة النسيجية، يتم ختم قوالب agarose التي تحتوي على organoids بطانة الرحم مع agarose، تليها التثبيت مع 4٪ شبهformaldehyde بين عشية وضحاها.
تتم معالجة هذه القوالب لبارافين القياسية تضمين مقطعة وملطخة لل نفس الأنسجة، المناعةfluorescence، أو الكيمياء المناعية. يكشف الهماتوسلين في تلطيخ إيوسين عن بنية تشبه الزفير مع طبقة واحدة من الخلايا التي تبطن السطح الخارجي والخلايا في المركز. تكشف العلامات الخاصة بالخلايا للخلايا ذات بطانة الرحم والظهارية واللُخلى الظهارية عن الخلايا الظهارية المحيطة بالأعضاء مع الخلايا اللزجة في الوسط.
علامات علم وظائف الأعضاء بطانة الرحم تؤكد أن organoids بطانة الرحم احتفظت خصائص معينة من الأنسجة الأصلية. ثلاثي الكروم تلطيخ، الذي يلطخ الكولاجين الأزرق والخلايا الحمراء، ويظهر وجود الكولاجين داخل المركز حيث الخلايا القوية يقيم، مما يدل على الإنتاج النشط وإفراز الكولاجين من قبل الخلايا السترومية مماثلة للأنسجة الأصلية. بالإضافة إلى ذلك، يكشف التلطيخ المناعي الكيميائي عن وجود مستقبلات الإستروجين، مستقبلات الاندروجين، ومستقبلات البروجسترون في كل من الخلايا الظهارية والوماضة.
من المهم أن نجهز الخلايا بكثافة بحيث يكون لدينا ما يكفي من الأعضاء لتجارب المصب. هذا سوف يستغرق بعض الممارسة. يمكن استزراع العضيات بطانة الرحم في ظل ظروف مختلفة ومن ثم حصادها لتجارب مثل الكيمياء المناعية أو تلطيخ المناعة لدراسة التعبير البروتيني أو حصادها للرنا لدراسة التعبير الجيني.
يحقق مختبرنا في كيفية استجابة بطانة الرحم لمستويات الهرمونات المتغيرة، والتي يمكن أن تؤدي إلى تضخم بطانة الرحم والسرطان. يمكننا استخدام هذه الأعضاء لعلاجات طويلة الأجل من الهرمونات وإضافة الظروف المرضية مثل التستوستيرون الزائد الموجود في متلازمة المبيض المتعدد الكيسات، أو إشارات من الخلايا الشحمية لدراسة التغيرات بطانة الرحم الناجمة عن السمنة. وتعتبر الأنسجة البشرية لتكون الخطر البيولوجي، وسيكون من المهم اتخاذ الاحتياطات المناسبة.
