هذه الطريقة يمكن أن تساعدنا على تصور تحركات الأوعية الدموية داخل كبد الفأر على طول تطور ديناميات الكبد في أبعاد متعددة. باستخدام هذه الطريقة، يمكننا تصور ديناميات الأوعية الدموية داخل الكبد في ثلاثة أبعاد. لقد أثبتنا استخدام صبغة الأوعية الدموية ، ولكن يمكنك إجراء تلطيخ الأوعية بمادة اهتمامك قبل التصور المجهري.
بعد تأكيد عدم وجود حق منعكس في تخدير ثمانية أسابيع من العمر الذكور C 57 أسود ستة الماوس. مسح ذيل الماوس مع الكحول 75٪، واستخدام حقنة ميكروليتر واحدة مجهزة إبرة قياس 30 لحقن 10 ملليغرام لكل ملليلتر من رودامين B Isothiocyanate-Dextran المعدة حديثا في 100 ميكرولتر من رودامين B Isothiocyanate-Dextran في الوريد الذيل الذهبي. عندما يتم تسليم كل من الحل استخدام مسحة القطن لممارسة الضغط على موقع ثقب واستخدام الشاش الرطب مع الماء العقيم لنقع الفراء البطن.
استخدام شفرة حلاقة لحلاقة البطن، مما يجعل السكتات الدماغية في اتجاه الفراء، ووضع الماوس على درجة حرارة 37 درجة مئوية، والكحول تطهيرها وسادة التدفئة. لإصلاح كبد الماوس بإطار تصوير أعضاء الجسم ، ضع أولا كوب شفط نظيف قطره خمسة ملليمترات في وضع ثابت ومسح لوحة التدفئة وكأس الشفط بالكحول بنسبة 75٪. قم بتوصيل كوب الشفط بخرطوم مضخة الفراغ ثم قم بتشغيل المضخة.
على طاولة تعقيم الكحول 75٪استخدام مقص الجراحية لقطع سنتيمترين من الجلد من الحدود السفلية القصية للفأر وفضح الكبد. ضع الماوس ولوحة التدفئة على قاعدة الحامل في إطار الجسم وضبط جهاز التصوير لاعبا اساسيا بحيث كوب شفط يمكن أن تعقد الكبد. ثم استخدم الضغط السلبي من 30 إلى 35 كيلوباسكال للشفط بحيث يعلق الكبد على الكأس.
لإعداد المجهر متعدد الفوتون ليزر المسح الضوئي بدوره على المجهر وحدد الهدف 60 X. إصلاح الإطار والفأرة تحت الهدف وإضافة قطرة من المالحة العادية إلى كوب كبير بما يكفي لتغطية العدسة. ضبط الهدف بحيث العدسة يمس فقط المالحة العادية وبدوره على برنامج الليزر.
قم بتشغيل الليزر واضغط مع الاستمرار على زر الطاقة والمصراع لمدة ثلاث ثوان. ثم بدء تشغيل المجهر البرمجيات وتعيين الليزر إلى 800 نانومتر. لضبط التحكم في الحصول على الصورة انقر فوق مفتاح الفلورسنت وإيقاف تشغيل أضواء الغرفة والمعدات.
افتح مصراع مسار الضوء على المجهر وتناوب مرشح الفلورسينس إلى العتاد الرابع. سحب اثنين من العتلات من التبديل البصري وتبحث من خلال قطعة العين، واستخدام الدورة وغرامة التركيز شبه اللوالب لضبط البعد البؤري. ثم استخدم محاور س ص لضبط مجال الرؤية لتحديد موقع المنطقة المستهدفة.
للتصوير، قم بإيقاف تشغيل مفتاح الفلورسنت في البرنامج وبدل فلتر الفلورسنت إلى الترس الثاني. دفع اثنين من العتلات من التبديل البصري وانقر فوق التركيز مرتين لمعاينة المنطقة المستهدفة ضبط إعدادات الاستحواذ والمعلمات التحكم في اقتناء الصورة والتحكم في الصحافة بالإضافة إلى C لضبط كسب الجهد العالي والإزاحة. انقر فوق إيقاف لإيقاف المعاينة، وانقر فوق الزر س ص لمسح في بعدين وانقر فوق حفظ.
حدد منطقة وانقر فوق العمق والمعاينة لتحديد النهاية وبدء مجموعات في إعدادات المجهر. مسح الصور ثلاثية الأبعاد وحفظها. بعد المسح الضوئي، حدد وقت نقر المنطقة وضبط إعدادات الاستحواذ الأخرى والمعلمات التي يتم التحكم فيها للحصول على الصورة.
ثم تفحص من خلال شرائح مختلفة وحفظ للحصول على الفيلم الصورة الناتجة. هنا يمكن ملاحظة تصور توزيع الأوعية الدموية داخل الكبد باستخدام المجهر الفوتون متعددة كما هو موضح. وينقسم هذا الأوعية الدموية إلى عدد وافر من الفروع المنبثقة من جذع وتوزيعها في الفضاء المحيط.
يمكن ملاحظة المحيط الخارجي للأوعية الدموية باللون الأحمر بينما يكون التجويف الداخلي مظلما ، كما لوحظ في الفيديو يمكن أن تكون الأجسام غير الحمراء التي تتحرك داخل الأوعية خلايا. من المرجح أن يكون ظلام الأنسجة الملاحظ في هذا الفيديو بسبب عدم إصلاح الكبد بشكل جيد بمرور الوقت. من المهم أن نتذكر أن كيفية إصلاح الكبد ندبة أقل، ويؤثر على استقرار الصورة.
ويمكن أيضا تطبيق هذه المنهجية على موقف الهياكل الأخرى داخل الكبد للمراقبة المباشرة للتوزيع أو التغييرات في هياكل العمل المحددة ذات الاهتمام.
