This study is supported by the Dutch Heart Foundation and the Netherlands Institute for Regenerative Medicine.

هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية LUMC لجنة أخلاقيات البحوث الحيوانية. 1. إعداد الآلات، الثقافة المتوسطة، وتلك الخلايا ملاحظة: إجراء كافة الاستعدادات في غطاء تدفق الصفحي. ووصف تلك الخلايا غرفة نضح، فخ فقاعة وموقف في ليبر وآخرون، 2010 (11). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير ملقط ومقص الجزئي مع 70٪ من الإيثانول. تحضير حقنة 5 مل مع 21G إبرة مع معقم تايرود العازلة (130 ملي كلوريد الصوديوم، 5.4 ملي بوكل، 6.0 ملي HEPES، 1.2 ملي MgSO 4، 1.2 مم KH 2 PO 4، 20 ملي الجلوكوز، 1.5 ملي CaCl 2 .2H 2 O، الرقم الهيدروجيني = 7.2). تحضير حقنة 5 مل مع 21G إبرة بمحلول معقم بوكل (100 ملم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 65 مل من المتوسط ​​في القلب: DMEM تستكمل مع 10٪ الجنين العجل المصل، مضاد حيوي / مضاد فطري (A / A؛ 100 وحدة من البنسلين، 100 ميكروغرام من الستربتومايسين، و 0.25 ميكروغرام من الأمفوتريسين B / مل)، الانسولين Transferrin-السيلينيوم (ITS، و 10 ميكروغرام / مل الأنسولين، و 5.5 ميكروغرام / مل ترانسفيرين، 6.7 نانوغرام / مل سيلينات الصوديوم) وفلتر تعقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم غرفة نضح وفخ فقاعة عن طريق الرش مع 70٪ من الإيثانول والجافة مع منشفة ورقية. تجميع تلك الخلايا (الشكل 1D)، ومع ذلك، في البداية دون غرفة التروية. ضع في فخ فقاعة على الوقوف. استخدام مضخة الأسطوانة تحوي سهلة الحمل رؤساء المضخة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام أنبوب السيليكون إجراء اتصالات بين الخزان (أنبوب 50 مل)، ومضخة، مضخة وفخ فقاعة، في فخ فقاعة وخزان (انظر الشكل 1D). جعل الأنابيب داخل الحاضنة لفترة كافية للسماح المتوسطة للوصول إلى التوازن الغاز مع غاز في الحاضنة من خلال أنابيب الغاز قابلة للاختراق السيليكون (1 م) وأنابيب خارج الحاضنة قصيرة قدر الإمكان. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء أنبوب 50 مل مع 70٪ من الإيثانول، بدوره على مضخة (سرعة تدفق حوالي 1 مل / دقيقة للسماح التداول السليم)، والسماح للسي آي آر الإيثانولculate لمدة 30 دقيقة لتعقيم جميع الأنابيب. إزالة الإيثانول عن طريق إفراغ الخزان وتضخ الايثانول من النظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء أنبوب 50 مل بالماء المقطر المعقم، بدوره على مضخة والسماح للتعميم الماء لمدة 30 دقيقة للتخلص من الايثانول المتبقية. إزالة المياه من خلال تفريغ الخزان وتضخ المياه من النظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء أنبوب 50 مل مع 45 مل من المتوسط، وضعت الوقوف في الحاضنة. بدوره على (سرعة تدفق حوالي 1 مل / دقيقة) مضخة وتعميم المتوسطة لملء جميع الأنابيب، وإزالة جميع فقاعات الهواء، والسماح للالمتوسطة على التكيف مع تركيبة الغاز في الحاضنة لمدة 1 ساعة على الأقل. الحفاظ على الحاضنة في ظروف الأنسجة الثقافة القياسية (5٪ CO 2 و 37 ° C). ضمان عدم وجود فقاعات موجودة في الأنبوب. </li></ol> 2. عزل القلب ماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الفأر مع 500 وحدة من الهيبارين. هذا سوف يمنع الدم من التخثر، وتتيح للإزالة بlood من القلب. بعد 10 دقيقة، تخدير الماوس في غرفة الاستقراء مع 4٪ الأيزوفلورين باستخدام المرذاذ الدقة. التخدير كافية عندما الماوس لا يستجيب لقرصة أخمص قدميه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الماوس إلى لوحة تشريح والحفاظ على التخدير عن طريق قناع متصلة الدائرة المحورية. تطهير الفراء من الفأر مع الكحول 70٪. باستخدام مقص فتح تجويف البطن لفضح الوريد الأجوف والحجاب الحاجز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفضح القلب، وجعل الشقوق الجانبية ابتداء من آخر من الأضلاع الأولى وتعكس القفص الصدري فوق رأس الفأر. وقف التخدير كما الماوس لا يتنفس بعد الآن. مراقبة القلب النابض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ادخال الإبرة 21G تعلق على حقنة 5 مل تحتوي على العازلة العقيمة تايرود في الوريد الأجوف السفلي من البطن إلى داخل التجويف الصدري (من خلال الحجاب الحاجز). تأكد من أن الدم يمكن الخروج من الذيلية الوريد الأجوف من غرز الإبرة. يروي عشرالعازلة البريد تايرود بلطف ومع الضغط المستمر في الوريد الأجوف حتى يفقد القلب جزئيا لونه أحمر. ملاحظة: لا يزال قلب ينبض السماح للإزالة الدم من القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال الإبر مع إبرة 21G تعلق على حقنة 5 مل تحتوي على حل بوكل العقيمة. يروي بلطف الحل بوكل في الوريد الأجوف حتى يتوقف القلب النابض وإزالة الإبرة. ملاحظة: الحل بوكل يحافظ على القلب في مرحلة الانبساطي استرخاء، والتي سوف تسمح الإدراج أسهل من الإبر نضح ونضح من نظام التاجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قليلا رفع القلب باستخدام ملقط المنحنية وباستخدام مقص تشريح القلب خالية من الأنسجة المحيطة ولكن ترك الشرايين والأوردة القريبة إلى القلب سليمة وتعلق على القلب. نقل قلب لأنبوب 15 مل تحتوي تستكمل PBS الجليد الباردة مع مضاد حيوي / مضاد فطري (A / A). تخزين قلب في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة لمدة تصل إلى 3 ساعات. </li></ol> 3. Cannulatioن من قلوب ماوس في غرفة الإرواء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ كافة الإجراءات في غطاء تدفق الصفحي. تستكمل نقل قلب معزولة عن أنبوب 15 مل إلى صحن 10 سم بيتري وإضافة PBS مع A / A. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح، استخدم مقص الجزئي وملقط لإزالة جميع الأنسجة غير القلب ولكن الحفاظ على الأبهر الصاعد إلى ما لا يقل عن التشعب مع الشريان العضدي الرأسي والأوردة الرئوية، 2 مم الأقرب إلى القلب. قطع غيض من قمة القلب إلى خلق الوصول إلى تجويف البطين الأيسر (عادة 2 ملم). وضع غرفة نضح في غطاء تدفق تحت المجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق حقنة 5 مل مع المتوسطة إلى الإبرة إدراج باستخدام أنابيب السيليكون. ملء غرفة نضح مع 20 مل المتوسطة ووضع القلب في مرحلة التناوب بين الإبر اضعافها 2 في غرفة نضح (الشكل 1). ضبط ارتفاع مرحلة التناوب بحيث يتم وضع القلب أمامالإبر. </li></ol> 4. من ربط لزراعة صمام تاجي (انظر الشكل 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ligate الشريان الأورطي مع خياطة (الحرير 7.0). Ligate لاحقة الأذين الأيسر مع خياطة. ادخال الإبرة (رقم 1 في الشكل 1) عن طريق الوريد الرئوي إلى الأذين الأيسر وligate مع خياطة الأقرب إلى دخولها في الأذين الأيسر. تأكد من أن الإبرة ليست بعيدة جدا في الأذين الأيسر حيث أن ذلك من شأنه أن يؤدي إلى تلف الصمام التاجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ادخال الإبرة (nr.2 في الشكل 1) مع الحركة الخطية إلى البطين الأيسر. نقل متوسطة من غرفة نضح إلى أنبوب 50 مل. ختم الإبرة إلى عضلة القلب مع الغراء حيويا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن يجف الغراء، وضخ بعناية متوسطة إلى القلب من خلال ربط حقنة مليئة المتوسطة إلى إبرة nr.1 ومعرفة ما اذا كان هناك أي تسرب. تأكد من أن مخارج المتوسطة من nr.2 إبرة وperfused الدم آخر ما تبقى من القلب. </li></ol> 5. لىgation لزراعة صمام الأورطي (انظر الشكل 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ادخال الإبرة (nr.1 في الشكل 1) في الشريان الأورطي وligate مع خياطة. تأكد من أن الإبرة ليست بعيدة جدا في الشريان الأورطي لأن هذا من شأنه أن يؤدي إلى تلف الصمام الأبهري. ادخال الإبرة (nr.2 في الشكل 1) مع الحركة الخطية إلى البطين الأيسر. نقل متوسطة من غرفة نضح إلى أنبوب 50 مل. ختم الإبرة إلى عضلة القلب مع الغراء حيويا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن يجف الغراء، وضخ بعناية المتوسطة في القلب من خلال ربط حقنة مليئة المتوسطة إلى إبرة nr.2 ومعرفة ما اذا كان هناك أي تسرب. تأكد من أن مخارج المتوسطة من nr.1 إبرة وperfused الدم آخر ما تبقى من القلب. </li></ol> 6. ضع غرفة الإرواء على حامل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تملأ غرفة نضح مع 20 مل نقل متوسطة. وضع طوقا وغطاء على غرفة وتشديد مع غسالة ومسامير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة تلك الخلايا تجميعها من incubaتور. نعلق غرفة نضح على الوقوف. توصيل أنابيب (انظر الشكل 1D). وضع الوقوف في حاضنة (5٪ CO 2 و 37 ° C). توصيل الأنابيب إلى المضخة. بدوره على مضخة مع سرعة تدفق نحو 600 ميكرولتر / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن في الخزان و / أو فخ فقاعة مستوى المتوسطة يسمح للتصورات وجود تدفق قبل سقوط قطرات المتوسطة واردة. بعد والثقافة، وإزالة القلب من النظام، الثابتة وتجهيزها للفحص النسيجي. </li></ol>

<ol>
	<li>Go, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Disease+and+Stroke+Statistics--2014+Update:+A+Report+From+the+American+Heart+Association.">Heart Disease and Stroke Statistics--2014 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 129, e28-e292 (2013).</li><li>Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+and+Cellular+Response+Feedback+in+Calcific+Aortic+Valve+Disease.">Hemodynamic and Cellular Response Feedback in Calcific Aortic Valve Disease.</a> Circulation Research. 113 (2), 186-197 (2013).</li><li>Kruithof, B. P. T., Krawitz, S. A., Gaussin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrioventricular+valve+development+during+late+embryonic+and+postnatal+stages+involves+condensation+and+extracellular+matrix+remodeling.">Atrioventricular valve development during late embryonic and postnatal stages involves condensation and extracellular matrix remodeling.</a> Developmental biology. 302 (1), 208-217 (2007).</li><li>Schoen, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+valves+and+valvular+pathology:+update+on+function,+disease,+repair,+and+replacement.">Cardiac valves and valvular pathology: update on function, disease, repair, and replacement.</a> Cardiovascular pathology: the official journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 14 (4), 189-194 (2005).</li><li>Balachandran, K., Sucosky, P., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamics+and+mechanobiology+of+aortic+valve+inflammation+and+calcification.">Hemodynamics and mechanobiology of aortic valve inflammation and calcification.</a> International journal of inflammation. , 263870 (2011).</li><li>Butcher, J. T., Simmons, C. A., Warnock, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+the+Aortic+Heart+Valve.">Mechanobiology of the Aortic Heart Valve.</a> The Journal of heart valve disease. 17 (1), 62-73 (2008).</li><li>Balachandran, K., Konduri, S., Sucosky, P., Jo, H., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+study+of+the+biological+properties+of+porcine+aortic+valves+in+response+to+circumferential+cyclic+stretch.">An ex vivo study of the biological properties of porcine aortic valves in response to circumferential cyclic stretch.</a> Annals of biomedical engineering. 34 (11), 1655-1665 (2006).</li><li>Weiler, M., Hwai Yap, C., Balachandran, K., Padala, M., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+analysis+of+dynamic+deformation+characteristics+of+native+aortic+valve+leaflets.">Regional analysis of dynamic deformation characteristics of native aortic valve leaflets.</a> Journal of Biomechanics. 44, 1459-1465 (2011).</li><li>Combs, M. D., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+development:+Regulatory+networks+in+development+and+disease.">Heart valve development: Regulatory networks in development and disease.</a> Circulation Research. 105, 408-421 (2009).</li><li>Kruithof, B. P. T., Duim, S. N., Moerkamp, A. T., Goumans, M. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;+and+BMP+signaling+in+cardiac+cushion+formation:+lessons+from+mice+and+chicken.">TGF&#946; and BMP signaling in cardiac cushion formation: lessons from mice and chicken.</a> Differentiation; research in biological diversity. 84 (1), 89-102 (2012).</li><li>Lieber, S. C., Kruithof, B. P. T., Aubry, N., Vatner, S. F., Gaussin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+miniature+tissue+culture+system+to+culture+mouse+heart+valves.">Design of a miniature tissue culture system to culture mouse heart valves.</a> Annals of biomedical engineering. 38 (3), 674-682 (2010).</li></ol>

The authors declare no conflicts of interest.

وتشمل الخطوات الحاسمة في زراعة الصمامات الماوس القلب مما يجعل الوقت بين استئصال القلب من الماوس وربط في غرفة نضح قصيرة قدر الإمكان لضمان سلامة وربط الإبر عمودي على الصمامات لضمان الاتجاه الصحيح من تدفق . بالإضافة إلى ذلك، والتحقق من تدفق بعد ربط في غرفة نضح دون المتو...

مرض صمام القلب هو سبب رئيسي للمراضة والوفيات في العالم الغربي. انتشاره يزيد مع التقدم في السن ويؤثر على أكثر من 10٪ من السكان 75 سنة فأكثر 1. صمامات الجزء النظامية للقلب، والصمام الأورطي والتاجي، ومعظمهم من المتضررين. يتميز مرض صمام القلب من جراء فقدان هيكل درجة عالية من التنظيم للصمامات، الذي ينتج تغيير في الخواص الميكانيكية 2. السلامة الهيكلية ذلك فمن الأهمية البالغة وظيفة الصمام. وتتألف منشورات صمام الخلايا صمامي الخلالي (VIC)، الخلايا البطانية صمامي (VEC)، والمصفوفة خارج الخلية، الذي يتم تنظيمه للغاية في نمط الطبقات 3،4. وفيكس هي المسؤولة عن تركيب ECM، وتدهور والتنظيم. العوامل النابعة من مجرى الدم، ECS أو المقيمين في فعل ECM على فيكس بتدبير وظيفتها. بالإضافة،تعمل القوى الميكانيكية على النشرة خلال دورة القلب مما أدى إلى الصفحي أو إجهاد القص متذبذبة، يؤكد الضغط أو الشد التأثير على سلوك فيكس 5. من أجل فهم كيفية تنظيم هيكل صمام، يجب أولا أن يفهم كيف فيكس لرد على مجموعة متنوعة من المحفزات شهدت خلال دورة القلب. وقد تم في الدراسات المختبرية مفيدة للغاية حول خصائص وقدرات الخلايا صمامي. استجابة هذه الخلايا في المختبر، ومع ذلك، قد لا تحاكي بدقة دائما الاستجابة في الجسم الحي 6؛ على سبيل المثال، استجابة للمؤثرات VIC تعتمد على وجود ECS وتكوين ECM 5. وعلاوة على ذلك، واستجابة خلايا صمامي للمنبهات تعتمد على مواقعها المحددة في النشرة 7. بالإضافة إلى المحفزات الحيوية، يتم تحديد سلوك الخلايا صمامي من قبل القوات الميكانيكية س يتصرفن صمام 8. يخضع كل منطقة من صمام لتشكيلتها الخاصة من الضغوط الدورة الدموية. على الرغم من أن النماذج الحالية فيفو السابقين قد أظهرت أن القوى الميكانيكية هي محددات هامة للبنية صمامي 5، والآليات المرتبطة بها لا تزال غير واضحة. في حين قدمت النماذج في الجسم الحي نظرة ثاقبة الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطوير صمامي 9،10، نظرة ثاقبة صمامي البيولوجيا الكبار لا تزال بعيدة المنال. لذلك، تم وضع فيفو السابقين نموذج تدفق فيه صمامات القلب يمكن تربيتها في وضع طبيعي في القلب لفترة طويلة من الزمن 11. هذا له ميزة أنه لا تزال الصمامات في شكلها الطبيعي وفيكس تجربة نفس البيئة كما هو الحال في الجسم الحي، مما يجعل ردود فيكس للمحفزات طبيعية قدر الإمكان. وبالإضافة إلى ذلك، فإن ثقافة الصمامات في وضعهم الطبيعي في قلب يسهل إخضاع كلالمنطقة صمامي لضغوط الدورة الدموية ذات الصلة. في هذا النموذج المجراة سابقا، أي نظام زراعة الأنسجة مصغرة (تلك الخلايا)، والصمامات يمكن أن تتعرض لمختلف المحفزات الحيوية والدورة الدموية مما يتيح للتحقيق لدورهم في القلب إعادة عرض الصمام.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selenium</td><td>Life Technologies</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic</td><td>Life Technologies</td><td>15240-06</td><td></td></tr><tr><td>Silk 7-0</td><td>Ethicon</td><td>768G</td><td></td></tr><tr><td>100 mm culture dish</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tube</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>5 ml syringe</td><td>BD</td><td>309649</td><td></td></tr><tr><td>21 G needle</td><td>BD</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>LEO</td><td>012866-08</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-00</td><td></td></tr><tr><td>Micro Scissors, Economy, Vannas-type</td><td>Tedpella</td><td>1346</td><td></td></tr><tr><td>Silicon tubing</td><td>Thermo Scientific</td><td>8060-0020</td><td>I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm</td></tr><tr><td>Silicon tubing for pump</td><td>Masterflex</td><td>96400-13</td><td>I.D. x O.D. x Wall: 0.8 x1.59 x 0.40 mm</td></tr><tr><td>Biocompatible glue (Histoacryl)</td><td>B. Braun</td><td>1050071</td><td></td></tr><tr><td>precision vaporizer</td><td>Dr&amp;auml;ger</td><td>Vapor 200</td><td></td></tr><tr><td>peristaltic roller pump</td><td>Masterflex</td><td>7521-35</td><td></td></tr><tr><td>Easy-load pump head</td><td>Masterflex</td><td>7518-00</td><td></td></tr><tr><td>Flow chamber</td><td></td><td></td><td>see Lieber &lt;i&gt;et al.,&lt;/i&gt; 2010</td></tr><tr><td>Bubble trap</td><td></td><td></td><td>see Lieber &lt;i&gt;et al.,&lt;/i&gt; 2010</td></tr></tbody></table>

culturing mouse cardiac valves in the miniature tissue culture system

Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the molecular, cellular and mechanical mechanisms underlying the maintenance and/or loss of the valvular structure. 
Current models used to study valvular biology include in vitro cultures of valvular endothelial and interstitial cells. Although, in vitro culturing models provide both cellular and molecular mechanisms, the mechanisms involved in the 3D-organization of the valve remain unclear. While in vivo models have provided insight into the molecular mechanisms underlying valvular development, insight into adult valvular biology is still elusive. 
In order to be able to study the regulation of the valvular 3D-organization on tissue, cellular and molecular levels, we have developed the Miniature Tissue Culture System. In this ex vivo flow model the mitral or the aortic valve is cultured in its natural position in the heart. The natural configuration and composition of the leaflet are maintained allowing the most natural response of the valvular cells to stimuli. The valves remain viable and are responsive to changing environmental conditions. This MTCS may provide advantages on studying questions including but not limited to, how does the 3D organization affect valvular biology, what factors affect 3D organization of the valve, and which network of signaling pathways regulates the 3D organization of the valve.

الصمام الأبهري (الشكل 2) أو صمام تاجي 11 يمكن أن يكون مثقف لمدة 3 أيام على الأقل. من خلال زراعة في موقف فتح (والذي يمثل موقف الانقباضي للالصمام الأبهري وموقف الانبساطي للصمام التاجي)، تظل خلايا صمامي قابلة للحياة. يتم احترام أي موت الخلايا على النحو الذي ي?...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Mouse Cardiac Valves in the Miniature Tissue Culture System at JoVE.com

Culturing Mouse Cardiac Valves in the Miniature Tissue Culture System

Here, we present an ex vivo flow model in which murine cardiac valves can be cultured allowing the study of the biology of the valve.

زراعة ماوس القلب صمامات في مصغرة نظام زراعة الأنسجة

Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the ...

culturing-mouse-cardiac-valves-in-the-miniature-tissue-culture-system

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.8K Views.  Leiden University Medical Center. Here, we present an ex vivo flow model in which murine cardiac valves can be cultured allowing the study of the biology of the valve.

Video: Culturing Mouse Cardiac Valves in the Miniature Tissue Culture System

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-&#946;1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

في المختبر ثقافة خلايا النخابية من الفأر الجنينية القلب

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium ...

Engineering

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed results. However, the cellular and molecular mechanisms of the neotissue development, valve thickening, and stenosis development are not researched extensively. To answer the above questions, we developed a murine heterotopic heart valve transplantation model. A heart valve was harvested from a valve donor mouse and transplanted to a heart donor mouse. The heart with a new valve was transplanted heterotopically to a recipient mouse. The transplanted heart showed its own heartbeat, independent of the recipient&#8217;s heartbeat. The blood flow was quantified using a high frequency ultrasound system with a pulsed wave Doppler. The flow through the implanted pulmonary valve showed forward flow with minimal regurgitation and the peak flow was close to 100 mm/sec. This murine model of heart valve transplantation is highly versatile, so it can be modified and adapted to provide different hemodynamic environments and/or can be used with various transgenic mice to study neotissue development in a tissue engineered heart valve.

In order to understand the cellular and molecular mechanisms underlying neotissue formation and stenosis development in tissue engineered heart valves, a murine model of heterotopic heart valve transplantation was developed. A pulmonary heart valve was transplanted to recipient using the heterotopic heart transplantation technique.

زرع صمام الرئوي عن طريق نموذج الفأر من غيري مكاني القلب زرع

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

Medicine

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

رواية<em&gt; خارج الحي</em&gt; الطريقة الثقافة لالجنينية القلب

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Biology

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

العزلة وثقافة الكبار ماوس العضلية للاشارة الخليوي و<em&gt; في المختبر</em&gt; تضخم القلب

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects in these vessels represent severe health risks such as in atherosclerosis, which can lead to myocardial infarctions and heart failures in patients. Consequently, coronary artery disease is one of the leading causes of death worldwide. Despite its clinical importance, relatively little progress has been made on how to regenerate damaged coronary arteries. Nevertheless, recent progress has been made in understanding the cellular origin and differentiation pathways of coronary vessel development. The advent of tools and technologies that allow researchers to fluorescently label progenitor cells, follow their fate, and visualize progenies in vivo have been instrumental in understanding coronary vessel development. In vivo studies are valuable, but have limitations in terms of speed, accessibility, and flexibility in experimental design. Alternatively, accurate in vitro models of coronary angiogenesis can circumvent these limitations and allow researchers to interrogate important biological questions with speed and flexibility. The lack of appropriate in vitro model systems may have hindered the progress in understanding the cellular and molecular mechanisms of coronary vessel growth. Here, we describe an in vitro culture system to grow coronary vessels from the sinus venosus (SV) and endocardium (Endo), the two progenitor tissues from which many of the coronary vessels arise. We also confirmed that the cultures accurately recapitulate some of the known in vivo mechanisms. For instance, we show that the angiogenic sprouts in culture from SV downregulate COUP-TFII expression similar to what is observed in vivo. In addition, we show that VEGF-A, a well-known angiogenic factor in vivo, robustly stimulates angiogenesis from both the SV and Endo cultures. Collectively, we have devised an accurate in vitro culture model to study coronary angiogenesis.

In vitro models of coronary angiogenesis can be utilized for the discovery of the cellular and molecular mechanisms of coronary angiogenesis. In vitro explant cultures of sinus venosus and endocardium tissues show robust growth in response to VEGF-A and display a similar pattern of COUP-TFII expression as in vivo.

في المختبر نموذج الأوعية التاجية

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

عزل خلايا الفئران صمام غشائي

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

العزلة والثقافة وتنبيغ الخلايا العضلية ماوس الكبار

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. Adult mammalian CMs are terminally differentiated cells with minimal proliferative capacity. The post-mitotic state of adult CMs not only restricts cardiomyocyte cell cycle progression but also limits the efficient culture of CMs. Moreover, the long-term culture of adult CMs is necessary for many studies, such as CM proliferation and analysis of gene expression.
The mouse and the rat are the two most preferred laboratory animals to be used for cardiomyocyte isolation. While the long-term culture of rat CMs is possible, adult mouse CMs are susceptible to death and cannot be cultured more than five days under normal conditions. Therefore, there is a critical need to optimize the cell isolation and long-term culture protocol for adult murine CMs. With this modified protocol, it is possible to successfully isolate and culture both adult mouse and rat CMs for more than 20 days. Moreover, the siRNA transfection efficiency of isolated CM is significantly increased compared to previous reports. For adult mouse CM isolation, the Langendorff perfusion method is utilized with an optimal enzyme solution and sufficient time for complete extracellular matrix dissociation. In order to obtain pure ventricular CMs, both atria were dissected and discarded before proceeding with the disassociation and plating. Cells were dispersed on a laminin coated plate, which allowed for efficient and rapid attachment. CMs were allowed to settle for 4-6 h before siRNA transfection. Culture media was refreshed every 24 h for 20 days, and subsequently, CMs were fixed and stained for cardiac-specific markers such as Troponin and markers of cell cycle such as KI67.

Here, we present a protocol for the isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes.

العزلة، وTransfection، والثقافة طويلة الأجل من الماوس الكبار والجرذان Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) play an important role in the calcification process in aortic stenosis through the activation of their dedifferentiation program to osteoblast-like cells. Mouse VICs are a good in vitro tool for the elucidation of the signaling pathways driving the mineralization of the aortic valve cell. The method described herein, successfully used by these authors, explains how to obtain freshly isolated cells. A two-step collagenase procedure was performed with 1 mg/mL and 4.5 mg/mL. The first step is crucial to remove the endothelial cell layer and avoid any contamination. The second collagenase incubation is to facilitate the migration of VICs from the tissue to the plate. In addition, an immunofluorescence staining procedure for the phenotype characterization of the isolated mouse valve cells is discussed. Furthermore, the calcification assay was performed in vitro by using the calcium reagent measurement procedure and alizarin red staining. The use of mouse valve cell primary culture is essential for testing new pharmacological targets to inhibit cell mineralization in vitro.

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

This article describes the isolation of mouse aortic valve cells by a two-step collagenase procedure. Isolated mouse valve cells are important for performing different assays, such as this in vitro calcification assay, and for investigating the molecular pathways leading to aortic valve mineralization.

عزل خلايا الصمام الخلالي الماوس لدراسة تكلس الصمام الأبهري في المختبر

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...

Calcification Assay to Measure Calcium Concentration in Aortic Valve Interstitial Cells

Source: Bouchareb, R. et al., <a href="https://app.jove.com/v/62419">Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro.</a>&#160; J. Vis. Exp. &#160;(2021).
This video demonstrates an assay technique for assessing the calcification of the aortic valve interstitial cells in vitro. The assay helps to quantify the calcium concentration using the arsenazo III reagent, a calcium-sensitive dye that reacts with calcium ions to form a purple-colored calcium-arsenazo complex.

فحص التكلس لقياس تركيز الكالسيوم في الخلايا الخلالية للصمام الأبهري

Source: Bouchareb, R. et al., Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro.&#160; J. Vis. Exp. ...

زراعة ماوس القلب صمامات في مصغرة نظام زراعة الأنسجة

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video