مع التلاعب optogenetic من مجموعات عصبية محددة أو مناطق الدماغ، يمكن تعديل السلوك مع ارتفاع دقة الزمان والمكانية في الحيوانات تتحرك بحرية. باستخدام أدوات optogenetic مختلفة في تركيبة مع الألياف البصرية المزروعة بشكل مزمن، يمكن تنفيذ مجموعة متنوعة من التشكيلات العصبية والاختبار السلوكي. الهدف النهائي من optogenetics هو تعديل الدوائر العصبية مع ارتفاع الدقة الزمانية والمكانية في الحيوان يتصرف.
على النقيض من التلاعب الدوائي أو الكهربائي ، يسمح optogenetics بالتحكم الدقيق لأنواع خلايا محددة على الدوائر العصبية. Optogenetics هو الطريقة المثلى لاستهداف أنواع خلايا محددة في منطقة محددة خصيصا أثناء السلوك ، والتدقيق في التأثير المباشر للتغيرات في هذه الدوائر الدقيقة. سوف نقدم الآن خطوة إلى خطوة دليل كيفية إعداد ونزرع وإجراء optogenetics في الفئران تتحرك بحرية.
لإعداد زرع البصرية، ووضع السيراميك شقي الجانب شقة حتى في فيز مقاعد البدلاء. تعري رمز من 200 ميكرومتر الألياف الزجاجية قطرها، مع أداة تجريد الألياف وقطع قطعتين إلى ثلاثة سنتيمترات غير مع ناسخ الألياف السيراميك. ضع قطعة من الألياف الزجاجية في شراك السيراميك ثم ضع قطرة فوق جزيرة في الجانب المسطح مع علبة حقن.
على الجانب جولة من الزبر السيراميك، وقطع الألياف الزجاجية قصيرة قدر الإمكان ووضع ما قبل زرع في عفريت تلميع حماس لتلميع الجانب جولة على أربع ورقات نشر مختلفة. بعد ذلك، قطع الألياف الزجاجية على الجانب المسطح من نسيج السيراميك، إلى الطول اللازم للزرع. استخدم أطلس دماغ الماوس لحساب طول الزرع.
يجب أن تنتهي الغرسة مباشرة فوق المنطقة ذات الأهمية. قبل الزرع، يتم تطبيق التخدير. يتم وصف التقنية الدقيقة والجمالية في المخطوطة.
عندما يصل الفأر إلى حالة عميقة من التخدير، وضعه على لوحة التدفئة وإصلاح الرأس في إطار مجسم. إصلاح الأنف والأسنان في الجبهة والأذنين على كلا الجانبين. تطبيق algesia مع شبه خماسي في الجزء الخلفي من الفأرة وتطبيق مرهم العين معتمة على كلتا العينين لحمايتهم من التجفيف.
ترطيب الشعر على فروة الرأس بمنشفة ورقية مبللة ثم قطعه باستخدام مقص. تأكد من إزالة جميع الشعر فضفاضة مع منشفة ورقية مبللة. استخدمي عصا قطنية لتطهير فروة الرأس بصبغة تحتوي على اليود.
رفع فروة الرأس حول المنطقة ذات الاهتمام مع ملاقط وقطع سنتيمتر واحد على طول خط الوسط. لتخشين الجمجمة لزرعها، وتطبيق كمية صغيرة من حمض الفوسفوريك على ندبة والسماح لها نافذة المفعول لمدة 15 ثانية. إزالة جميع حمض مع عصا القطن وشطف الندبة مع كلوريد الصوديوم مرتين.
للحقن السليم، حساب عامل F للإحداثيات الفردية. ضع كوبًا مجسمًا في الإطار المجسم وحدد مكانه مباشرة فوق bregma. الآن صفر نظام الإحداثيات ونقل القنية الزجاجية إلى لامبدا.
حساب عامل F مع الصيغة التالية. Bregma ناقص لامبدا مقسوما على 4.2 يساوي عامل F. إحداثيات دقيقة جدّا مهمّة لحقن وغرس لأنّ خلاف ذلك, إن البنية خاطئة يكون حفزت بعد ذلك التأثيرات سلوكيّة غيرمّيّن.
جميع الفئران لديها الحد الأدنى من الانحرافات في حجم جمجمتها ، وبالتالي ، فإن المعامل إلزامي للغاية. استخدام الإحداثيات المعدلة للعثور على موقع على ندبة مباشرة فوق هيكل الفائدة. استخدام قنية الحقن لحفر حفرة في الجمجمة، عن طريق تناوب القنية على الفور.
لاتخاذ حل فيروس في القنية الزجاجية المتصلة بحقنة، ووضع قطرة من كلوريد الصوديوم على الجمجمة وقطعة من بيروفين على القمة. وضع قطرة من اثنين من حل الفيروس microliter على بيروفين وخفض غيض من قنية الزجاج في الفيروس. تطبيق الضغط السلبي والانتظار حتى يتم تناول حل الفيروس من قبل cannula.
صفر إلى أن التنسيق عندما غيض من الفيروس مع قنية هو على مستوى الجمجمة وخفض ببطء في حفرة إلى أدنى موقف من الجانب الحقن. تطبيق كمية صغيرة من الضغط الإيجابي مع الحقنة حتى يتم خفض الغضروف المفصلي. دع الفيروس ينتشر لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق قبل تحريك القنية الزجاجية إلى الأعلى إلى الموضع التالي.
إزالة القنية الزجاج ببطء شديد وتجاهله بعد الحقن النهائي. الآن أعد الجمجمة للزرع. جفف الجمجمة بالهواء المضغوط، ضعي التمهيدي مع هذه العصا المقابلة واتركها جافة لمدة 15 ثانية.
تطبيق السندات مع العصا نفسها وعلاجه لمدة 20 ثانية مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية. ضع الغرسة في حامل المقابلة ووضع غيض من الألياف الزجاجية مباشرة فوق البئر وخفضها بعناية. توقف عن خفض الزرع عندما يلمس الصمام المتبقي من الغليدو الفائق الجمجمة.
ويمكن أيضا زرع الألياف البصرية للهياكل الثنائية مثل قرن آمون. وهذا يتيح التحفيز الطفيف في كلا نصفي الكرة الأرضية في نفس الوقت أو يسمح بتحفيز هيكلين مختلفين. ومن الممكن أيضاً حقن الفيروس في مكان مختلف عن زرع الألياف البصرية.
إذا كان يتم الحقن والزرع في مناطق مختلفة، حفر جميع الثقوب اللازمة بعد تطبيق حمض الفوسفوريك ولكن قبل التصاق المكونين. تحقق مرة أخرى إذا كانت الجمجمة لا تزال جافة تماما، ثم تطبيق الاسمنت الأسنان السائل حول الزرع وفي المنطقة المحيطة ثم علاج لمدة 20 ثانية مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية تطبيق اثنين من الاسمنت أقل في الفراء تماما منطقة الجمجمة الحرة والمجففة. علاج كل طبقة مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
لإنهاء الجراحة تطبيق مسحة اليود على الجرح كله. إطلاق تثبيت الأنف والأذن، وجلب الماوس إلى قفص جديد ووضعها تحت مصباح التدفئة لتجنب فقدان حرارة الجسم. تحقق من الحالة الصحية على الأقل مرة واحدة في اليوم ، وسوف بعد المنطوق و algesia بعد ثلاثة أيام إذا لزم الأمر.
بعد أسبوعين من الانتعاش، يمكن استخدام الفئران للتجارب السلوكية. افتح برنامج Pulser وحدد منفذ USB com الذي يتم توصيل مصدر الضوء به. اختر وضع التشغيل الثالث للسماح لبرنامج خارجي بالتحكم في مصدر الضوء.
اختر الضبط الصحيح لـ 20 هرتز التحفيز مع خمس مللي ثانية نبضة ضوئية. لتحديد موقع التقسيم للاتصال مع pulser، اضغط على تسلسل البداية. وتبقى هذه الحالة حتى تنتهي التجارب.
الآن، إنشاء تجربة جديدة في EthoVision XT، انتقل إلى ملف، واختيار جديد من قالب وحدد تطبيق قالب محدد مسبقا. اختيار التتبع الحية واختيار الكاميرا مع المصدر وتأكيد كاميرا Puslar جين العين المتصلة. اختيار الماوس كما الحيوان الذي ينبغي أن تسجل.
حدد قالب الساحة، ساحة الحقل المفتوحة ومركز قالب المنطقة، والحدود، والزوايا. تأكيد موضوع واحد الذي ينبغي أن تتبع وتحديد نقطة مركز، الأنف نقطة وقاعدة الذيل. تأكيد لون الحيوان مقارنة مع الخلفية هو أغمق ومعدل العينة الموصى بها لإنهاء الخطوة.
قم بتسمية التجربة المناسبة واختر موقعًا لحفظه. حتى تجد إعدادات الساحة، ستقوم الكاميرا بفتح صورة خلفية تلقائيًا. تكييف المناطق المحددة مسبقا إلى الساحة الحقيقية باستخدام السهم واثنين من الرموز على انها الحق.
إذا كانت بعض المناطق غير ضرورية، قم بحذفها. اضغط على مقياس الرسم لمعايرة ووضع خط من زاوية واحدة من المتاهة إلى أخرى. أدخل طول المسافة الحقيقية في السنتيمتر.
كرر ذلك للمحور الآخر. لتحديد إعدادات التحكم التجريبية، قم بإعداد القاعدة الرئيسية عن طريق ضبط وقت الشرط إلى 20 دقيقة. الشرط لستار تريك ينبغي أن يكون، عندما يكون الموضوع في الساحة لمدة ثانيتين، لحالة تلقائية من تتبع عندما يكون الماوس في الساحة.
لإنشاء قاعدة فرعية لتحفيز الضوء، انتقل إلى الهياكل، والمزيد وحدد القاعدة الفرعية. وضعه تحت القاعدة الرئيسية وانتشرت خارج مربعين. انتقل إلى الشروط والوقت وإعطائها اسما مثل الضوء على واحد، ويتم تعديل شرط مع بعد خمس دقائق.
ضع المربع خلف مربع بدء القاعدة مباشرةً. انتقل إلى إجراء الأجهزة المخصصة وتسمية مع الضوء على واحد. حدد الإجراء لأداء: أنا وضع واحد عالية.
ضع المربع خلف مربع الشرط مباشرةً. كرر الخطوات التي يتم تشغيل ضوء البرنامج عليها في الضوء. الآن انتقل إلى بنيات، مرجع القاعدة الفرعية وتحقق من أن المرجع ينتمي إلى القاعدة الفرعية الصحيحة.
اختر شروط البدء بدون تأخير وشروط البدء كما يتم تنفيذها مرة واحدة لكل حالة بدء. ضع مربع المرجع بين الكتب الإضافية واحد و دفاتر الشروط اثنين من القاعدة الرئيسية. الآن تحديد إعدادات الكشف عن لإظهار النظام ما ينبغي أن تتبع.
ضع أميال اختبار في الساحة وحدد الإعداد التلقائي. اختيار القوارض كنوع واستخدام مؤشر الماوس لرسم مربع حول الفئران في الساحة. تأكيد نتائج سؤال الرعاية مع نعم.
لتجربة حقل مفتوح، جلب الماوس التجريبي إلى غرفة السلوك الحق قبل التجربة لضمان مستوى مناسب من القلق. زوجان الماوس يكون شقا من مصدر الضوء عن طريق الضغط عليه بلطف إلى شبكة القفص. وضعه في قفص الانتظار مع القمامة الطازجة لمدة 10 دقائق للحصول على التأقلم مع كابل الضوء.
ابدأ عملية الاكتساب بالضغط على زر الإيقاف و إلى رؤية XT. نقل الماوس من قفص الانتظار في الزاوية اليسرى العليا من الحقل المفتوح. اترك المجال البصري للماوس أثناء التجربة واحفظ الهدوء. بعد 20 دقيقة، عند الانتهاء من التجربة، وإزالة الماوس من المتاهة، وقطع كابل ضوء وضعه مرة أخرى في قفص الخاصة بها.
من خلال فحص التصور ، يمكن رؤية الاختلافات في وقت المركز بين الضوء والضوء على الوجوه مباشرة. الماوس تنفق وقتا أقل في المركز عندما يكون الضوء على. لتجربة متاهة بارنز، جلب جميع الفئران التجريبية في غرفة السلوك حوالي ساعة واحدة قبل التجربة.
إعداد المتاهة بارنز عن طريق إغلاق جميع الثقوب ما عدا واحد، والآن الذي يتم وضع مربع الهروب. توصيل فأر واحد في مصدر الضوء في كل من يزرع ووضعها مباشرة في منتصف المتاهة بارنز. اضغط بدء وتحتاج إلى زيارة T المقبل وإزالة مربع الكرتون.
تكون على استعداد لوقف المحاكمة يدويا فقط في حالة البرنامج لا تعترف الانتقال كله. أخرج الماوس من المتاهة وأزل الاتصال بكابل الضوء. عند أداء، والتعلم، ومهمة الذاكرة، لا يتم التحقيق في التأثير الفوري للتلاعب فقط، ولكن أيضا تأثير طويل الأجل للتلاعب أثناء الاكتساب، الدمج أو الاسترجاع.
لتحليل البيانات، تجد حالة العلاج المعالجة أو التي تسيطر عليها، انتقل إلى التداخل وتحديد حالة التحكم التجريبي. اختيار الفاصل الزمني للدولة من العنصر عمل ستار تريك إلى ضوء العمل عنصر يذهب على واحد. ضع مربع التداخل بين معالجة مربع التصفية ومربع النتيجة المقابل.
هذا الفاصل الزمني المحدد هو واحد. كرر الخطوات للفواصل على واحد من اثنين وعلى اثنين أيضاً لمجموعة التحكم. كما حدد المعلمات التي سيتم تحليلها في ملف تعريف التحليل.
اختر المتغير التابع في المنطقة وحدد مركز المنطقة ونقطة الجسم ونقطة الوسط واتدخل في إحصائيات تجريبية. حدد التكرار والمدة التراكمية واسمحوا هناك لرؤية الأول. أضف أيضًا حركة المسافة كمتغير.
مع هذا التشكيل الجانبي، تتوفر البيانات عن الوقت الذي يقضيه في مركز، مركز الإدخالات وقال إلى نقل المسافة. لاستخراج البيانات من كل قسم، انتقل إلى النتائج وحدد الإحصائيات والرسوم البيانية، اضغط على حساب لرؤية البيانات التي تم تحليلها. اضغط على بيانات التصدير وحدد إحصائيات التجربة والموقع الذي سيتم حفظه.
يتم حفظ البيانات المصدرة كملف Excel ومع قيم فردية لكل ماوس. بالإضافة إلى ذلك، انتقل إلى الخريطة الحرارة التصور والصحافة خرائط مؤامرة الحرارة، والتجارب حدد على اليمين لرؤية خرائط الحرارة الفردية لكل الماوس والمحاكمة. القيام بزر الماوس الأيمن على الماوس وتصدير خرائط الحرارة والصور.
في وقت لاحق، فتح ملف إكسل الكمبيوتر وحساب متوسط وSCM يورو القياسية لجميع التجارب الأربع وكل مجموعة تكييف قياسها. لتوليد الرسوم البيانية والمؤامرة سيغما ، ونسخ الوسائل وSCM في الترتيب الصحيح من ملف إضافي لمؤامرة سيغما. الصفوف يجب أن تحتوي على البيانات ل off واحد على واحد، والأعمدة تحتوي على الإصدار التجريبي، يعني و SCM هرتز.
حدد الأعمدة الثلاثة جميعها ثم انتقل إلى إنشاء الرسومات البيانية. حدد مربع الشريط واختر مربع غير مجمع مع سهم. تسمية الرسم البياني بأكمله، انتقل إلى المنزل، حدد مربع الرسم البياني واضغط على التصدير.
حدد المجلد الوجهة واختر ملف التعريف كشكل. لحساب إحصائيات البيانات التي تم الحصول عليها، نسخ البيانات الصحيحة من Xcel واحد على واحد، وهلم جرا، وإلى أعمدة واحدة من مؤامرة سيغما. وضع علامة على الأعمدة التي تريد مقارنتها والذهاب إلى التحليل، ثم اختر اختبار T واضغط على تشغيل.
وأخيراً، يمكن عرض البيانات السلوكية مقسمة إلى السماح بها وعلى التجربة مع تخصص إضافي في الخريطة الحرارية. في التجربة الميدانية المفتوحة ، أثناء التحفيز الخفيف من Channelrhodopsin2 والخلايا العصبية الهرمية ، يتم تقليل مدة المركز ، مما يشير إلى زيادة مستويات القلق. عن طريق الكيمياء المناعية، يمكن تحديد موقع الحقن والتعبير عن الفيروس، وأيضا في خصوصية في خط الماوس الخاص كريس تعتمد يمكن التحقق من صحتها.
يمكن للمرء أن يرى بوضوح أن التحفيز الضوئي من Channelrhodopsin2 تحسين الخلايا العصبية العقل من هذه المنطقة القشرة محددة يزيد من مستويات القلق، مقارنة مع القلق خط الأساس قبل أن التحفيز. هذا التأثير الفوري للتلاعب على السلوك هو السبب في استخدام optogenetic اليوم لأسئلة البحث الكثير بشأن السلوك. يمكن استخدام هذا الإجراء للتشكيل Optogenetic من أي نوع الخلية المطلوبة أو الدوائر العصبية في الدماغ الماوس.
من خلال الجمع بين هذا الإجراء مع الاختبارات السلوكية المناسبة لأبحاثك، يمكن الحصول على نظرة أعمق في الدوائر العصبية المشاركة في السلوكيات والأمراض ذات الاهتمام.
