البروتوكول الذي نقدمه هنا سيكون مفيداً لنا لفهم كيفية مشاركة الخلايا اللمفاوية في تطوير مرض المناعة الذاتية للجهاز العصبي المركزي. مع هذه الطريقة، يمكن دراسة الخلايا الليمفاوية في الدماغ دراسة على أساس خلية من قبل الخلية. ويمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول على نماذج أخرى وأمراض الجهاز العصبي المركزي التي تحتاج إلى تحليل خصائص ووظائف الخلايا المناعية.
في هذا الفيديو، يمكن للبروتوكول أن يوضح بسهولة كيفية حث النموذج وعزل الخلايا الفردية في الدماغ. بعد التأكد من عدم وجود استجابة لدواسة منعكس، واستخدام حقنة ملليلتر واحد لحقن تحت الجلد C57BL/6 الفئران مع 100 ميكروغرام من MOG مستحلب 35-55 في 100 ميكرولترات من مساعد فروند كاملة في موقعين مختلفين من الظهر بالقرب من الرقبة. في نفس اليوم وفي اليوم الثاني بعد التحصين ، حقن داخل الصفاق الفئران مع 200 ميكرولتر من نانوغرام واحد لكل ميكرولتر السعال الديكي السموم حل.
بعد الحقنة الثانية، نقل الفئران مرة أخرى إلى قفص وطنهم مع وسادة الاحترار والرصد حتى إعادة شغل كامل. في اليوم التالي وطوال فترة المرض ، فحص ورتب جميع الفئران بطريقة عمياء للعلامات العصبية المبينة في الجدول ولأي تغييرات في الوزن. عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة، قم بقطع الجمجمة بعناية من الأنف إلى الرقبة ونقل دماغ كل من صندوق الجمجمة إلى أنابيب فردية 50 ملليلتر تحتوي على 10 ملليلترات من متوسط RPMI.
خلط الأنابيب جيدا لإزالة خلايا الدم الحمراء الملتزم بها وإزالة المتوسطة عن طريق الطموح. إضافة 10 ملليلتر من المتوسطة الطازجة إلى كل أنبوب ونقل العقول إلى أطباق فردية 100 ملليمتر. وأخيرا فرم كل دماغ مع شفرة حلاقة واستخدام ماصة بلاستيكية لنقل قدر الأنسجة من طبق واحد في وقت واحد وستة ملليلتر من المتوسط إلى الجليد سبعة ملليلتر محورها التجانس الزجاج.
طحن الدماغ باستخدام المكبس فضفاضة من الحشرات قبل استخدام المكبس ضيق لجلب الأنسجة حتى تعليق متجانسة. ثم، صب الطين الأنسجة الناتجة في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر مبردة مسبقا على الجليد. عندما تم تجانس جميع العينات، وضبط حجم في كل أنبوب إلى سبعة ملليلتر مع المتوسطة الطازجة، قبل إضافة كل تعليق الأنسجة إلى أنبوب جديد المبرد 15 ملليلتر تحتوي على ثلاثة ملليلتر من 100٪ مصفوفة غشاء الطابق السفلي لكل أنبوب.
مزيج عن طريق عكس عدة مرات واستخدام ماصة ملليلتر ثلاثة بعناية وببطء إضافة ملليلتر واحد من 70 في المئة حل التدرج كثافة تحت كل عينة حل الأنسجة. فصل الخلايا بواسطة كثافة التدرج الطرد المركزي وإزالة تقريبا كل من الطبقة العليا، مع الحرص على إزالة تماما من myelin. نقل واجهة في أنبوب جديد 15 ملليلتر وضبط مستوى الصوت إلى 10 ملليلتر مع المتوسطة الطازجة.
ثم الطرد المركزي العينات مرة أخرى وإزالة supernatant قبل resuspending الكريات في حوالي 100 ميكرولترات من المتوسط لكل أنبوب. لتحليل تدفق الخلايا للخلايا للخلايا المخ المحصودة، تخصيص ما يقرب من مرتين 10 الخلايا الست في 100 ميكرولترات من المتوسط في آبار فردية من لوحة 96 جيدا. عندما تم مطلي جميع الخلايا، إضافة 100 ميكرولترات من 500X كوكتيل تحفيز الخلايا بالإضافة إلى مثبطات نقل البروتين إلى الآبار ووضع لوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة أربع ساعات.
في نهاية تجمع الحضانة الخلايا في الجزء السفلي من الآبار عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الكريات في 100 ميكرولترات من تدفق العازلة قياس الخلايا في البئر. قبل احتضان الخلايا مع ثلاثة microliters من المضادة للماوس CD16/CD32 FC بلوك لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية قبل تلطيخ. لمنع أي تفاعلات غير محددة بوساطة Fc.
في نهاية الحضانة، إضافة كوكتيل الأجسام المضادة من الفائدة لكل بئر ووضع لوحة في أربع درجات مئوية محمية من الضوء. بعد 30 دقيقة، وغسل الآبار مع 100 ميكرولترات من تدفق عازلة قياس الخلايا في بئر ورواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي. بعد التخلص من المُنَازل، أضف 200 ميكرولترات من عازل التثبيت داخل الخلايا إلى كل بئر.
بعد حضانة 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وجمع العينات عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الكريات في 200 ميكرولترات من 1X نفاذية العازلة في بئر. الطرد المركزي العينات مرة أخرى، وبعد التخلص من supernatant، resuspend الكريات في 100 ميكرولترات مع عازلة permeabilization جديدة. بعد ذلك، إضافة الأجسام المضادة المناسبة للكشف عن أي مستضدات داخل الخلايا من الفائدة لاحتضان 30 دقيقة في أربع درجات مئوية، محمية من الضوء.
في نهاية الحضانة، إضافة 100 ميكرولترات من 1X عازلة permeabilization لكل بئر وتدور أسفل العينات عن طريق الطرد المركزي. ثم، resuspend الخلايا وصمة عار في 200 ميكرولترات من تدفق الخلايا التلطخ العازلة وتحليل الخلايا عن طريق تدفق القياسات وفقا للبروتوكولات القياسية. وينبغي أن يؤدي مسار السريرية النموذجية من EAE في منحنى المرض وتغيير في وزن الجسم كما هو موضح.
C57BL/6 الفئران المحصنة مع MOG 35-55 عادة ما تبدأ في تطوير أعراض المرض حول اليوم 10 إلى 12 وتحقيق ذروة المرض حول اليوم 15 إلى 21. قبل ظهور المرض ، يزداد وزن الجسم للفئران المحصنة تدريجيًا قبل أن يتناقص ارتباطًا مع أعراض المرض المتزايدة تظهر الفئران أدنى وزن في الجسم في ذروة EAE ، مع تعافي أوزان الجسم قليلاً مع انخفاض الأعراض السريرية. الفئران عادة لا يتعافى تماما ولكن وعادة ما تستمر لتطوير أمراض الأمراض المزمنة أحادية الطور.
كما يوضح هذا التحليل التدفق التمثيلي، يتم زيادة خلايا Th1 وTH17 المنتجة للانفيردون غاما بشكل كبير في فئران EAE. الخطوة الأكثر أهمية هي 3.10. يجب على المشغل نقل الطبقة الوسطى والضوء ، ويجري بعناية ، واتخاذ أقل عدد ممكن من الطبقات الأخرى.
بعد هذه البروتوكولات، يمكننا المزيد من الخلايا الليمفاوية T لمزيد من التحليل النسخي للدراسة
