우리가 여기에서 제시하는 프로토콜은 우리가 림프구가 중앙 신경계 자기 면역 질병의 발달에 어떻게 관련되는지 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 이 방법으로, 두뇌에 있는 림프구는 세포 기초에 의해 세포에서 공부할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 면역 세포의 특성 그리고 기능을 분석하는 데 필요한 그밖 모형 및 중추신경계 질병에 적용될 수 있습니다.
이 비디오에서 프로토콜은 뇌의 단일 세포를 모델링유도하고 격리하는 방법을 쉽게 입증할 수 있습니다. 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 피하 마취 C57BL / 6 마우스를 피하 주입하기 위해 1 밀리리터 주사기를 사용하여 100 마이크로 그램의 유화 MOG 35-55에 완전한 Freund의 보조제의 100 마이크로 리터는 목 근처의 두 개의 다른 부위에 주입하십시오. 같은 날과 둘째 날, 마이크로리터 등리소 작업 용액당 1나노그램의 200마이크로리터를 마우스에 내분한다.
두 번째 주사 후, 온난화 패드와 함께 자신의 홈 케이지에 다시 마우스를 전송하고 전체 recumncy까지 모니터링. 다음날 및 질병의 과정을 통해, 검사 및 테이블에 설명 된 신경 징후와 체중의 변화에 대한 맹목적인 방식으로 모든 마우스를 등급. 적절한 실험 적 종점에서, 코에서 목으로 두개골을 신중하게 잘라 RPMI 매체의 10 밀리리터를 포함하는 개별 50 밀리리터 튜브로 각 동물의 뇌를 전송.
튜브를 잘 섞어 부착된 적혈구를 제거하고 포부로 배지를 제거합니다. 각 튜브에 10 밀리리터의 신선한 매체를 추가하고 뇌를 개별 100밀리미터 요리로 옮킨다. 마지막으로 면도기로 각 뇌를 자르고 플라스틱 파이펫을 사용하여 한 번에 한 접시에서 많은 조직을 옮기고 6 밀리리터의 중간 밀리리터를 얼음처럼 차가운 7 밀리리터 중심의 유리 균질화로 옮춥춥시다.
서스펜션이 균일할 때까지 조직을 가져오기 위해 단단한 플런저를 사용하기 전에 페일의 느슨한 플런저를 사용하여 뇌를 갈아. 그런 다음, 얼음에 미리 차가운 15 밀리리터 원추형 튜브에 결과 조직 슬러리를 부어. 모든 시료가 균질화되면 각 튜브의 부피를 신선한 배지로 7 밀리리터로 조정한 후 각 조직 현탁액을 튜브 당 100% 지하 막 매트릭스 3밀리리터를 포함하는 새로운 냉장 15 밀리리터 튜브에 추가합니다.
반전을 몇 번 혼합하고 3 밀리리터 파이펫을 사용하여 각 조직 용액 샘플 아래에 70% 밀도 그라데이션 용액의 1밀리리터를 신중하게 천천히 추가합니다. 밀도 그라데이션 원심분리에 의해 세포를 분리하고 거의 모든 상단 층을 제거하여 모든 myelin을 완전히 제거합니다. 인터페이스를 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮기고 신선한 배지로 10 밀리리터로 볼륨을 조정합니다.
그런 다음 샘플을 다시 원심 분리하고 침투체를 제거한 후 튜브 당 약 100 마이크로리터의 중간 마이크로리터에서 펠릿을 다시 분리합니다. 수확된 뇌 세포의 유동 세포 측정 분석을 위해, 배지의 100 마이크로리터에 있는 6개의 세포에 대략 2회 10을 96웰 플레이트의 개별 우물으로 할당합니다. 모든 세포가 도금되면 500X 세포 자극 칵테일의 100 마이크로리터와 단백질 수송 억제제를 우물에 추가하고 4시간 동안 세포 배양 배양 배양에 플레이트를 배치합니다.
인큐베이션 풀의 끝에서 원심분리에 의해 우물 의 바닥에 있는 세포를 잘 당 유동 세포 분석 버퍼의 100 마이크로리터에서 펠릿을 재연한다. 염색하기 전에 섭씨 4도에서 10 분 동안 안티 마우스 CD16 / CD32 Fc 블록의 3 개의 마이크로 리터로 세포를 사전 배양하십시오. 특정하지 않은 Fc 매개 상호 작용을 차단합니다.
인큐베이션이 끝나면 각 우물에 관심있는 항체 칵테일을 추가하고 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에 접시를 놓습니다. 30 분 후, 우물당 100 마이크로 리터의 유동 세포측정 완충제로 우물을 씻고 세포를 원심분리에 의해 퇴적시한다. 수퍼넌츠를 폐기한 후 각 웰에 세포 내 고정 버퍼 200 마이크로리터를 추가합니다.
실온에서 30~60분 간 배양한 후, 원심분리로 샘플을 수집하고 우물당 1X 투과성 버퍼의 200마이크로리터에서 펠릿을 재연한다. 원심 분리시 시료를 다시 한번 제거하고, 상퍼를 버린 후, 신선한 투과화 버퍼로 100 마이크로리터에서 펠릿을 재차 분리한다. 다음으로, 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에서 30분 동안 관심 있는 세포내 항원 검출을 위한 적절한 항체를 추가한다.
인큐베이션이 끝나면 각 웰에 1X 투과화 버퍼의 100 마이크로리터를 추가하고 원심분리로 시료를 스핀다운합니다. 이어서, 유동 세포분석 염색 버퍼의 200 마이크로리터에서 얼룩 세포를 재중단하고 표준 프로토콜에 따라 세포측정을 유동하여 세포를 분석한다. EAE의 전형적인 임상 과정은 그림과 같이 질병 곡선과 체중의 변화를 초래한다.
MOG 35-55로 면역화된 C57BL/6 마우스는 일반적으로 10일에서 12일 경에 질병 증상을 일으키기 시작하고 15일에서 21일 경에 질병의 피크를 달성한다. 질병의 발병 전에, 면역 마우스의 체중은 점차 증가 질병 증상과 상관 관계감소하기 전에 증가- 마우스는 EAE의 피크에 가장 낮은 체중을 입증, 임상 증상이 감소함에 따라 체중이 약간 회복. 마우스는 일반적으로 그러나 완전히 복구하지 않으며 전형적으로 단면 만성 질병 병리를 개발하기 위하여 계속합니다.
이러한 대표적인 유동 분석에서 알 수 있듯이, 인터페론 감마 생산 Th1 및 IL17 생산 Th17 세포는 EAE 마우스에서 현저히 증가한다. 가장 중요한 단계는 3.10입니다. 연산자는 중간 레이어와 빛을 조심스럽게 옮기고 가능한 한 적은 다른 레이어를 수행해야 합니다.
이러한 프로토콜에 따라, 우리는 추가 전사 분석을 위해 추가 T 림프구를 추가로 연구할 수 있습니다.
