يمكن استخدام بروتوكولنا لتحسين نوعية وكمية بيانات التعبير الجيني الناتجة عن عينات الحمض النووي الريبي المستمدة من FFPE، وخاصة في عينات الجودة دون الأمثل. هذه التقنية تقيم نوعية الحمض النووي الريبي داخل عينات أنسجة FFPE وتمكن من تحسين معالجة المصب لتحسين كمية ونوعية بيانات تسلسل العينة. وتسمح هذه الطريقة بالتوصيف الشامل للنصوص في العينة البيولوجية والسريرية، وقد توفر نظرة ثاقبة على العناصر الوظيفية للجينوم في مجال التنمية والمرض.
10- ويمكن أن يكون تدهور رنا FFPE واختيار الأساليب الخاصة بـ QC العينة وإعداد المكتبة وتحليل البيانات جميعها صعبة للغاية. كن دقيقا عند اختيار الطرق الصحيحة والضوابط المناسبة. عرض مرئي يسمح للمشاهدين لمراقبة التعديلات الدقيقة الصغيرة والاحتياطات اللازمة أثناء التخطيط والتقييم وعملية التسلسل خاصة بالنسبة للعينات FFPE المحفوظة بشكل سيئ.
للتحقق من جودة عينة الحمض النووي الريبي، قم بتشغيل العينة على نظام مراقبة الجودة الريبي الريبي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة واستخدام برنامج التحليل الحيوي المناسب لتحليل توزيع شظايا الحمض النووي الريبي داخل العينة وحساب نسبة الشظايا التي أطول من 100 و 200 نوكليوتيدات. استناداً إلى مقاييس مراقبة الجودة، حدد العينات التي بها أقل من 40٪ من الشظايا التي تزيد عن 100 نوكليوتيدات للسماح باستبعاد هذه العينات من المعالجة. لتسلسل، ذوبان مجموعات الكواشف التسلسل المناسبة وفقا لالمعلمات تشغيل في حمام الماء درجة حرارة الغرفة ووضع علبة الكاشف في أربع درجات مئوية بعد ذوبان الجليد.
ضع حزمة خلية التدفق في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. أثناء احترار الحزمة، افتح تطبيق إدارة تجارب Illumina وحدد إنشاء ورقة عينة. حدد المنظم ليتم استخدامه ثم انقر فوق التالي.
أدخل الباركود مجموعة الكاشف ومعلمات سير العمل المناسبة الأخرى. ثم قم بتحميل ورقة عينة تم إنشاؤها وفقًا لمعايير تسلسل Illumina. لإعداد مكتبة العينة ومكتبة التحكم PhiX ، قم بتكفير المكتبات وتمييعها إلى التركيزات المناسبة ومزج العينة ومكتبات التحكم في PhiX للحصول على نسبة حجم التحكم PhiX 5٪.
عندما تكون خلايا التدفق جاهزة، قم بإزالة الالتفاف، نظف السطح الزجاجي بمسحة كحولية خالية من الوبر، وجفف الزجاج بأنسجة مختبرية منخفضة الوبر. قم بإزالة خرطوشة الكاشف من التخزين أربع درجات مئوية وعكس الكارتريدج خمس مرات لخلط الكواشف. اضغط بلطف على الخراطيش على مقاعد البدلاء لتقليل فقاعات الهواء وتحميل العينة المشوهة والمخففة في خرطوشة الكاشف في الخزان المعين.
قم بتحميل خلية التدفق وخراطيش المخزن المؤقت وخراطيش الكاشف على النظام. ثم قم بإجراء فحص تلقائي ومراجعة الإخراج للتأكد من أن معلمات التشغيل تمرير تحقق النظام. عند اكتمال الفحص التلقائي، حدد البدء لبدء تشغيل التسلسل.
لتصور ما قبل معالجة QC وما بعد المحاذاة QC النتائج، تشغيل مراقبة الجودة متعددة لإنشاء تقرير مجمعة في تنسيق HTML. لتحديد تأثيرات الدُفعة ولتقييم خريطة الجودة لمجموعة البيانات المعطاة، استخدم برنامج نصي R لتشغيل تحليل مكون رئيسي. ويمكن بعد ذلك تحليل الارتباط عينة يمكن أن تنفذ باستخدام ارتباط بيرسون بين عينات مختلفة.
وتقدير نسبة الشظايا التي تزيد عن 100 نيوكليوتيدات أكثر فائدة من تقدير الشظايا التي تزيد عن 200 نيوكليوتيدات لأنها أكثر حساسية لقياس نسبة الأحجام الأصغر للأجزاء الدقيقة لعينات الحمض النووي الريبي الشديدة التحلل. نظراً لدرجة عالية من التدهور في مجموعة العينات، يوصى مجموع RNA طريقة إعداد مكتبة. على سبيل المثال، يتم عرض مكتبات تسلسلية تم إعدادها من أربع عينات مختلفة.
هنا، يتم عرض نظرة عامة على جودة تسلسل الملفات الأولية FastQ ومحتوى محول العينة. يمكن أن يساعد فحص FastQC في اكتشاف التلوث مثل التلوث البكتيري أو الماوس داخل العينات. يمكن استخدام محاذاة STAR لتحديد نسبة القراءات التي تم تعيينها إلى الجينوم المرجعي، ونسبة عمليات القراءة التي تم تعيينها بشكل فريد إلى الجينوم المرجعي، ونسبة عمليات القراءة التي لم يتم تعيينها، أو التي تم تعيينها إلى عدة loci.
يمكن استخدام إحصائيات البطاقة و RSeQC لتحديد النسبة المئوية من MESSENGER RNAs ، قواعد intronic و intergenic الموجودة في القراءات المعينة. بالنسبة لهذه التحليلات التمثيلية، كان لدى بعض المكتبات المتدهورة ثلاثة تحيز رئيسي تم فيه تعيين عدد أكبر من القراءات أقرب إلى الثلاثة الرئيسية أكثر من نهايتها الخمسة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء تحليل المكونات الرئيسية لتحديد النسبة المئوية للتباين الكلي الذي تم التقاطه بواسطة المكونات الرئيسية للتكاثر البيولوجي لكل عينة.
الحرص على تجنب تدهور العينة، وإعداد النسخ المتماثلة والمعاطف متعددة لكل عينة، واستخدام المقاييس المناسبة لتقييم نوعية العينة، واستخدام طريقة إعداد مكتبة الحق. باستخدام هذه المنهجية، يمكن إجراء دراسات أكبر NGS مع عينات FFPE غير صالحة للاستعمال من قبل مع أوقات وظروف تخزين متفاوتة للحصول على رؤى في مجموعة متنوعة من حالات المرض المختلفة. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لدراسة المحفوظات الكبيرة القائمة لعينة FFPE مع معلومات سريرية غنية ويمكن أن تعزز إلى حد كبير دراسات السرطان القائمة على السكان.
