الهدف العام لهذا الإجراء هو إنتاج وتنقية BDNF oviduct في بروتوكول محسن يتضمن transfection من خلايا HEK293 وتنقية في عمود الكروماتوغرافيا. ثم يتم اسخاء BDNF oviduct أحادية الحيوية من خلال تفاعل في المختبر للوسم الخلفي والكشف عن طريق المجهر الفلوري. والميزة الرئيسية لهذا الإجراء هو أنه يسمح بإنتاج وتنقية، أحادية الحيوية من BDNF بطريقة محسنة.
وقد تم تحسين المعلمات الحمل لأقصى إنتاج BDNF باستخدام كاشف نقل فعالة من حيث التكلفة ويتم تنفيذ عملية تنقية في إعداد الكروماتوغرافيا التي تسهل التلاعب ويسمح لتصعيد الإجراء. تبدأ من خلال تمييع 60 ميكروغرام من البولي إيثيلينمينمين في 500 ميكرولترات من DMEM غير الموردة و 20 ميكروغرام من BDNF oviduct plasmid في 500 ميكرولترات من DMEM غير الموردة لكل 15 طبق سنتيمتر ليتم نقل العدوى. احتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ومن ثم الماصات بعناية حل الحمض النووي في أنبوب بولي إيثيلينمينمين، وخلط مرة واحدة عن طريق أعلى / أسفل الحركة.
احتضان لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم بالتنقيط ملليلتر واحد من خليط PEI / الحمض النووي في جميع أنحاء كل طبق 15 سم. احتضان الخلايا بخليط PEI/DNA لمدة ثلاث ساعات ثم تغيير الوسيطة إلى الحضانة العازلة. بعد 48 ساعة من نقل الخلايا، وجمع المتوسطة من جميع الأطباق.
ثم إضافة مكونات متوسطة BDNF إلى عظمى HEK293 بما في ذلك كلوريد الصوديوم، والفوسفات المكونات المخزنة، imidazole، ومثبطات البروتياز. احتضان في الجليد لمدة 15 دقيقة. ثم aliquot المتوسطة في أنابيب الطرد المركزي.
جهاز طرد مركزي لمدة 45 دقيقة في 10،000 غرام في أربع درجة مئوية من الذهب الطرد المركزي. هذه الخطوة تسمح بإزالة حطام الخلية والخلايا الميتة التي تم تعليقها في وسائل الإعلام. ثم جمع ابر.
يضاف BSA بتركيز نهائي من 0.1٪ وتخزينها في ناقص 20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهرين. لتنقية BDNF، تبدأ من خلال ذوبان وسائل الإعلام في حمام 37 درجة مئوية الحرارية. ثم aliquot وسائل الإعلام في أنابيب الطرد المركزي.
أجهزة الطرد المركزي لمدة ساعة واحدة في 3,500 غرام في جهاز طرد مركزي ذهبي من الدرجة الرابعة. وتسمح هذه الخطوة بإزالة الحطام المتبقي لضمان التدفق الكافي عبر عمود الكروماتوغرافيا. ثم استخدام المكثفات البروتين للحد من وسائل الإعلام من 500 ملليلتر إلى 100 ملليلتر.
اتبع معلمات الطرد المركزي الموصى بها من قبل الشركة المصنعة للحصول على التركيز الأمثل. ثم إضافة 500 ميكرولترات من حبات النيكل-NTA أنغروس إلى وسائل الإعلام المركزة واحتضان بين عشية وضحاها في الروك في أربع درجات مئوية. في اليوم التالي، وتجميع جهاز الكروماتوغرافيا وصب وسائل الإعلام في ذلك.
السماح لها راحة لمدة خمس دقائق ومن ثم فتح الديك وقف في اتجاهين للسماح للتدفق المتوسط من خلال. غسل مع خمسة ملليلتر من العازلة غسل لمدة خمس دقائق التأكد من resuspend الخرز في العمود. كرر ثلاث مرات.
وأخيرا، إضافة ملليلتر واحد من عازلة elution إلى العمود مع التأكد من إعادة تعليق الخرز. احتضان لمدة 15 دقيقة ومن ثم جمع eluent في أنبوب microcentrifuge. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات ل يكتمل من BDNF.
لبيوتينيل BDNF، واتخاذ aliquot التي تحتوي على 800 نانوغرام من البروتين وإضافة كاشف العازلة biotinylation ومن ثم بعض BirA-GST في علاقة واحد إلى واحد مولا لBDNF. احتضان في فرن التهجين في 30 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، وخلط محتويات الأنبوب كل 15 دقيقة عن طريق عكس. ثم إضافة نفس حجم ATP وبيرا-GST كما هو الحال في الخطوة الأولى واحتضان لمدة 60 دقيقة، وخلط محتويات الأنبوب كل 15 دقيقة.
ويمكن بعد ذلك أن يترك BDNF الحيوي في الجليد للتحقق الفوري من استخداماتينات البيوتين أو تخزينه عند ناقص 80 درجة مئوية للتحليل الخلفي. للتحقق من اتينيل من oviduct BDNF، تبدأ عن طريق منع 30 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي streptavidin لكل عينة BDNF في عازلة حظر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ثم يعجل الخرز المغناطيسي في فاصل رف المغناطيسي ثم تجاهل العازلة حظر.
إضافة 50 microliters من العازلة منع جديدة وعينة BDNF إلى الخرز، والتأكد من resuspend لهم تماما. التجانس محتويات أنبوب واحتضان في أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة في دوار أنبوب microcentrifuge. إعداد العينة لنشاف الغربية كما هو موضح في النص لتقييم كفاءة تفاعل ثنائي الفينيل الحيوي.
لمقارنه BDNF oviduct إلى النقاط الكمّية، تبدأ بإضافة الحجم الضروري من النقاط الكمّية لتحقيق علاقة مُضَدّة واحد إلى واحد إلى BDNF ومن ثمّ تخفيفها إلى حجم نهائيّ من 20 ميكرولترات. التجانس محتويات الأنبوب ومن ثم التفاف عليه في رقائق الألومنيوم لحمايته من الضوء. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الروك.
ثم تمييع oviduct BDNF إلى التركيز النهائي المطلوب وإضافته إلى حجرة محور عصبي من غرفة microfluidic، والتحضين لمدة 210 دقيقة للتصوير الخلفي الحي أو ثابت الخلية. استخدام بروتوكول قائم على عمود الكروماتوغرافيا يسمح بمعالجة كميات كبيرة من وسائط HEK293 مكيفة. في هذه التجربة، تمت معالجة 500 ملليلتر من الوسائط المشروطة لتنقية BDNF oviduct.
أربعة من الدعامات المتتالية التي تدوم 15 دقيقة كل منها أسفرت عن انخفاض تركيزات من oviduct BDNF تتراوح بين ستة إلى 28 نانوغرام لكل ميكرولتر. وبلغ مجموع العائد نحو 60 ميكروغراما من oviduct BDNF. ثم تم تطهير BDNF المنقى من قبل التفاعل في المختبر بواسطة BirA-GST.
وكانت العينة متجانسة بيولوجياً كما يتضح من عدم وجود oviduct BDNF غير البيولوجية في تراكب من الخرز المغناطيسي الذي تم تطهيره. وتبين هذه النتائج أن البروتوكول المقترح يسمح بتنقية كميات كبيرة من كوفيتش BDNF ومتجانسة في ثنائي الفينيل أحادية في المختبر. ثم تم تقييم النشاط البيولوجي لـ BDNF أحادية اللون باستخدام نهجين تجريبيين مختلفين.
أولا، تم تحفيز الخلايا العصبية القشرية بذر في 60 ملليمتر لوحات مع 50 نانوغرام لكل ملليلتر من BDNF أحادية الحيوية لمدة 30 دقيقة ثم تم إعداد البروتينات لتحليل البقعة الغربية. تم تحديد النشاط البيولوجي لـ BDNF أحادية اللون من خلال الكشف عن phospho-TrkB وphospho-ERK. ربط BDNF إلى TrkB يؤدي إلى لصناعة السيارات في الفسففوريل من مستقبلات وتنشيط العديد من kinases المصب بما في ذلك ERK.
تم تضمين حالة التحكم السلبية التي لم يتم تحفيزها مع BDNF وحالة تحكم إيجابية والتي تم تحفيزها مع BDNF المتاحة تجاريا لتحليل النشاط البيولوجي BDNF oviduct. كانت النطاقات على حد سواء البروتينات الفوسفورية، وكان كثافة مماثلة في الخلايا العصبية تعامل مع BDNF التجارية وBDNF أحادية الحيوية، وأظهرت كل إشارة أقوى من حالة التحكم السلبي. ثم تم تقييم النشاط البيولوجي لـ BDNF أحادية الحيوية إلى جانب نقاط الكم streptavidin لإثبات أنه يمكن استخدامها في تجارب التصوير الحي.
تم زرع الخلايا العصبية القشرية في 10 ملليمتر يغطي وعولجت مع تركيز نهائي من 200 picomolar أو اثنين من النقاط الكمية BDNF نانومولار لمدة 30 دقيقة قبل تحديد وتلطيخ للفوسفو كريسب. CREB هو عامل النسخ الذي يستهدفه ERK12 المنشط في الخلايا العصبية القشرية. وأدى تحفيز الخلايا العصبية مع تركيزات متزايدة من النقاط الكمومية BDNF في زيادة الجرعة تعتمد على الفوسفور من CREB ووجود جزيئات نقطة الكم المحيطة النواة مما يشير إلى أن الجسيمات النقطة الكم BDNF كانت endocytosed وأثار تنشيط مسارات إشارة المرتبطة تنشيط TrkB بوساطة BDNF.
تم الكشف عن زيادة مزدوجة في إشارة فوسفو-كريب عندما حفز الخلايا العصبية مع 200 نقطة الكم BDNF picomolar بينما حفز مع اثنين من النقاط الكمية BDNF نانومولار أدى إلى زيادة 3.5 أضعاف في إشارة فوسفو كريب. ولذلك، فإن ثنائيات BDNF oviduct نشطة بيولوجياً ولا تفقد نشاطها عندما تقترن بنقاط الكم streptavidin مما يجعلها مناسبة للفلوروس المناعي وتصوير الخلايا الحية. وأخيراً، تم تقييم إمكانات التصوير للنقاط الكمومية BDNF في الثقافات المجزأة باستخدام غرف microfluidic.
تم زرع الخلايا العصبية القشرية في غرف microfluidic لفصل مقصورات محور عصبي وsmatodendritic وتم تحفيزها مع اثنين من النقاط الكمومية BDNF نانوولار لمدة 3.5 ساعة. تم إجراء مجهر الخلايا الحية واستخدمت الكايموغرافات الناتجة لتحديد سرعة النقطة الكمّية BDNF التي تحتوي على العضيات. تم الكشف عن متوسط سرعة الحركة 0.91 ميكرومتر في الثانية الواحدة وهو ما يتماشى مع التحليل السابق للنقل بالثيامين السيتوبلازمي.
لم تظهر الغرف الدقيقة المعالجة بنقاط كمية نانوية المولدة streptavidin نقاط كمية متحركة في المجموعات الصغيرة كما يظهر من قبل kymograph. تم تحفيز الخلايا التي تزرع في ظل نفس الظروف مع 500 بيكومورار أو نقطتي كمية BDNF نانومولار لمدة 210 دقيقة ثم ثابتة ووصفت مع وصمة عار نووية. تظهر الخلايا العصبية المعالجة بنقاط الكم BDNF تراكمًا يعتمد على الجرعة للبروتين المسمى في جميع الأقسام الفرعية المحللة بما في ذلك الأجزاء القريبة والهوية للمجموعة الصغيرة والمقصورة السومالية.
في المقابل، أظهرت الخلايا العصبية السيطرة تقريبا أي إشارة نقطة الكم في جميع أنحاء الغرفة. لذلك، يمكن الكشف عن نقطة الكم BDNF في الخلايا الحية والثابتة في الغرف microfluidic. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنتاج أحادية الحيوية BDNF oviduct في إجراء قائم على عمود الكروماتوغرافيا على أساس التكلفة.
