بروتوكول cPILOT الآلي يجعل من السهل على الباحثين تحليل العينات بطريقة عالية الإنتاجية. وهذا أمر مهم لأنه يسمح لنا للوصول إلى المعلومات البيولوجية حول الأمراض أو الظروف المختلفة أسرع بكثير. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تساعد على معالجة عينات متعددة في نفس الوقت، وبالتالي تقليل الأخطاء القابلة للتنفيذ أثناء استخدام عينات عالية الإنتاجية.
مختبرنا مهتم في التطبيقات المتعلقة بالشيخوخة ومرض الزهايمر. ومع ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لدراسة أي مرض أو تحد حيث هناك الأنسجة البيولوجية المعنية. تبدأ من خلال تشغيل جهاز الضغط الإيجابي، وجهاز التدفئة والتبريد، ومضخات التفريغ.
قم بتوصيل جميع الملحقات بالمعالج السائل، والذي سيظهر الضوء الأزرق بمجرد توصيله بالكمبيوتر وجاهز للعمل. Aliquot 300 ميكرولترات من تجانس الكبد في أنبوب 500 ميكرولتر ووضعها على لوحة بئر عميق اثنين ملليلتر. تخزين العينة عند أربع درجات مئوية حتى بداية البروتوكول.
فتح الأسلوب في البرنامج ووضع النصائح المطلوبة و labware في مواقعها. ثم الاختيار المتقاطع مع تخطيط سطح السفينة النهائي وانقر فوق التالي لمتابعة البروتوكول. تحميل 230 نصائح ميكرولتر وpirate 90 ميكرولترات من ثمانية المولى اليوريا من الخزان.
ثم الاستغناء عنه لصف واحد من الأسود اثنين ملليلتر لوحة جيدا عميق. افرغوا نصائح TL1 وكرروا هذه الخطوة حتى تتم إضافة اليوريا إلى جميع الآبار. بعد إضافة العازلة denaturation، استخدم 90 نصائح ميكرولتر لنقل 10 ميكرولترات من التجانس الكبد الماوس إلى لوحة بئر عميق.
تفريغ النصائح، ثم تحميل صف واحد من 90 نصائح ميكرولتر وpirate ثلاثة ميكرولترات من DTT من لوحة الكاشف واحد. الاستغناء DTT إلى الصفوف واحد واثنين من لوحة بئر عميق. ختم لوحة العينة مع رقائق الألومنيوم واحتضان ذلك في 37 درجة مئوية لمدة 600 ثانية في حين تدور في 300 دورة في الدقيقة.
بعد الحضانة، تحميل صف واحد من 90 نصائح ميكروليتر، ويتبخر ستة ميكرولترات من IAM من لوحة الكاشف واحد في الصف الثالث، والاستغناء عنه إلى صف واحد من لوحة عينة. ختم لوحة العينة واحتضانها في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة أثناء الدوران في 300 دورة في الدقيقة على جهاز التبريد. ثم فك الميكن لوحة العينة وتحميل صف واحد من 90 نصائح ميكرولتر.
سبيرت خمسة ميكرولترات من السيستين من لوحة الكاشف واحد في الصف الثاني والاستغناء عنه إلى الصفوف واحد واثنين من لوحة العينة. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، قم بإجراء هزة موقوتة من 1800 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
ثم إضافة 800 ميكرولتردات من 20 ملليمتر تريس العازلة مع كلوريد الكالسيوم 10 ملليمولار إلى كل بئر على لوحة العينة لتخفيف تركيز اليوريا إلى اثنين من الضرس. إضافة 20 ميكرولترات من التربسين إلى الصف الأول من لوحة 96 جيدا ووضع لوحة في موقع محدد على سطح السفينة. بعد إضافة التربسين إلى لوحة العينة، وختمه واحتضانه لمدة 15 ساعة في 37 درجة مئوية و 600 دورة في الدقيقة على جهاز التدفئة والتبريد.
وقف الهضم عن طريق التعرق 150 ميكرولترات من حمض 5٪ من حمض فليك من الصف الثالث من لوحة حمض الفورميك وصرفه إلى لوحة العينة في الصفوف واحد واثنين. المضي قدما إلى عدم التشبع الببتيدات. استخدام 1070 نصائح ميكرولتر لpirate 600 ميكرولترات من الأسيتونتريل.
ثم الاستغناء عنه في الصفوف واحد واثنين من استخراج المرحلة الصلبة، أو لوحة SPE، لتنشيط C-18. بعد ذلك، قم بتحميل العينة المهضمة إلى لوحة SPE في تمريرتين. تحميل صفين من النصائح، وpirate 534 ميكرولترات من العينات هضمها، وصرف لهم إلى الصفوف واحد واثنين من لوحة SPE.
تطبيق الضغط على لوحة وتكرار هذه الخطوة حتى يتم تحميل جميع العينات. تنظيف الببتيدات عن طريق غسل بالماء وتخفيف الببتيدات مع 60-40 الأسيتونيتريل في 0.1٪ حمض فريلك. ثم ضع لوحة على رأس لوحة جمع ل elute الببتيدات باستخدام جهاز الضغط الإيجابي.
ارسم التدفق من خلال إعداد النصائح المطلوبة و labware في البرنامج ، وتقاطع مع تخطيط سطح السفينة ، وانقر فوق التالي لمتابعة البروتوكول ل dimethylation. إعادة تكوين الببتيدات في حمض الخليك 1٪. لأداء وضع العلامات على ثنائي التحلل، قم بتحميل 90 نصيحة ميكروليتر و16 ميكرولترات من 60 ملليمولار ضوء الفورمالديهايد من الصف الثاني من لوحة الكاشف اثنين.
الاستغناء عن صف واحد من لوحة عينة، ثم تفريغ النصائح. تحميل صف واحد من 90 نصائح ميكرولتر وpirate 16 ميكرولترات من 60 ملليمولار الفورمالديهايد الثقيلة من الصف الثالث من لوحة الكاشف اثنين. الاستغناء عن صف اثنين من لوحة عينة وتفريغ النصائح.
تحميل صفين من 90 نصائح microliter وpirate 16 microliters من 24 ميليمولار الصوديوم سيانوبوروهيدريد و 24 ملليمولار الصوديوم cyanoborodeuteride من الصفوف واحد واثنين من لوحة الكاشف ثلاثة، ثم الاستغناء عن الكواشف إلى الصفوف واحد واثنين من لوحة عينة لبدء تفاعل ثنائي الفينيل. افرغ النصائح واستخدم الشاكر المداري لإجراء هزة موقوتة لمدة 15 دقيقة في 1800 دورة في الدقيقة. ثم تحميل صفين من 90 نصائح ميكرولتر وpirate 32 ميكرولترات من 1٪ الأمونيا من الصفوف ثلاثة وأربعة من لوحة الكاشف ثلاثة.
الاستغناء عنه في الصفوف واحد واثنين من لوحة عينة اثنين لوقف رد الفعل. الجمع بين وحدات التخزين على قدم المساواة من الببتيدات الباهتة الفاتحة والثقيلة في لوحة جديدة اثنين ملليلتر عميق جيدا لساللتينغ. بعد إزالة التشبع بالضوء والببتيدات الثقيلة ، جفف الببتيدات وأدي وضع علامات الهزوباريك.
إعادة تشكيل الببتيدات مع 100 ميكرولترات من 100 ميليمولار ثلاثية الإيثيلمونيوم bicarbonate العازلة على شاكر المدارية. ثم استخدم 90 نصائح ميكروليتر لpirate 25 ميكرولترات من الببتيدات dimethylated مجتمعة والاستغناء عنها إلى الصف الأول من لوحة معالجة TMT. تحميل صف واحد من 90 نصائح ميكرولتر وpirate 10 ميكرولترات من TMT.
الاستغناء عنه في الصف الأول من لوحة معالجة TMT، تفريغ النصائح، ثم تنفيذ هزة موقوتة لمدة ساعة واحدة في 1800 دورة في الدقيقة. التعرق ثمانية ميكرولترات من الهيدروكسيلمين من الصف الثاني من لوحة TEAB والاستغناء عنه إلى صف واحد من لوحة معالجة TMT. بعد اهتزاز 15 دقيقة في 1800 دورة في الدقيقة، نقل 30.5 ميكرولترات من الببتيدات TMT المسمى إلى أنبوب 1.5 ملليلتر.
ثم المضي قدما في الحصول على البيانات وتحليلها وفقا لتوجيهات المخطوطة. تظهر هنا بيانات MS التمثيلية لببتيد تم تحديدها في جميع القنوات الأيونية المراسلة 22 من 22 Plex مجتمعة السلائف النظائرية وتجربة وضع العلامات الهزوبية. تسلسل الببتيد يتوافق مع betaine-homocysteine S-ميثيلtransferase.
وكانت الأيونات المجزأة الأكثر كثافة لكل من القمم الباهتة الفاتحة والثقيلة معزولة أكثر لتفتت MS3. المراسل كثافة الأيونات هي متناسبة مباشرة مع وفرة الببتيد في العينة. وعموما، فإن هذه التسميات النظائرية المزدوجة وتجربة وضع العلامات الهزوبية التساوية تقلل من أوقات معالجة العينات وجعلت من الممكن تصور تعبير البروتين عبر قنوات أو ظروف متعددة.
المؤامرة مربع من سجل 10 وفرة مقابل إجمالي كثافة أيون مراسل عبر جميع القنوات 22 يظهر أقل بين البئر أو بين العينات المتغيرة. تم تقييم الأتمتة الإجمالية من خلال دراسة الخطأ في وفرة أيون المراسلين عبر كل بروتين في العينات الـ 22. وقد أدى تجهيز العينات باستخدام النظام الأساسي الروبوتي إلى معاملات منخفضة جداً من التباين.
عبر الببتيدات 3098، كان متوسط معامل الاختلاف في وفرة الأيونات المراسل 12.36 و 15.03٪ للببتيدات ذات الديمثيلات الخفيفة والثقيلة على التوالي. عند محاولة هذا البروتوكول، من المهم أن نضع في اعتبارنا أن المستويات التساوي والتساوي المستخدمة في تجربة واحدة. وبالتالي، يجب إجراء تخطيط دقيق لتعيين كل عينة مع العلامات المقصود استخدامها في التجربة.
ويمكن دمج هذه الطريقة بسهولة في أنظمة روبوتية أخرى، ويمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من الأنسجة، مثل الأنسجة أو الخلايا وغيرها من الفلورويدات الحيوية.
