يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في الخلايا الجذعية ومجالات السرطان مثل ما يبدو عليه عدم تجانس الخلايا الجذعية وكيف يمكن عزل العلاج في الخلايا السرطانية الحساسة. والميزة الرئيسية لهذه الدراسة هي أنها تجمع بين تحليل قوي تقنياً للتعبير الجيني أحادي الخلية جنباً إلى جنب مع vaccinosis لتوصيف آخر للمصب للسكان الفرعيين المستهدفين. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن استخدامها للتحقيق في السرطان وعدم تجانس الخلايا الجذعية، إلا أنها يمكن أن تعطي أيضًا رؤى حول إمكانية الفدائية الجينية والنسل.
لبدء البروتوكول، على مقاعد البدلاء RNA / الحمض النووي خالية، إعداد ما يكفي من عازلة تحلل ل96 آبار مع 10٪ اضافية عن طريق خلط 390 microliters نواة المياه الحرة، 17 ميكرولترات من 10٪NP-40، 2.8 ميكرولتررس 10 مللي دينوب، 10 ميكرولتررز 0.1 د تى الضرس، و 5.3 ميكرولترات RNAse المانع. دوامة وتدور أسفل الأنبوب. المقبل، وتوزيع أربعة microliters من عازلة تحلل إلى كل بئر من لوحة PCR 96 جيدا وختم لوحات مع فيلم لاصق.
تدور أسفل لوحات لجمع السائل في الجزء السفلي. إبقاء لوحات على الجليد حتى فرز الخلايا لمدة أقصاها 24 ساعة. مرة واحدة وقد تم إعداد الجهاز FACS بشكل صحيح، تنفيذ إعادة تحليل السكان المستهدفين عن طريق فرز ما لا يقل عن 100 الخلايا المستهدفة في أنبوب جديد microcentrifuge مع 100 ميكرولترات من العازلة وصمة عار.
FACS تحليل الخلايا التي تم فرزها عن طريق تسجيل العينة مفروزة والتأكد من أنها في نهاية المطاف في بوابة الفرز. ثم قم بإعداد فرز لوحة أحادية الخلية عن طريق تمركز الانخفاض في A1 بشكل جيد في لوحة 96-well. عندما يكون محورها، فرز 50 إلى 106 جزيئات ميكرومتر في جميع الآبار حول حافة لوحة فارغة 96-جيدا لضمان أن جميع الآبار سوف تحصل على خلية في وسط كل بئر.
إزالة الفيلم لاصق من لوحات. فرز خلية واحدة من لين CD34 زائد خلايا ناقص CD38 في 92 من أصل 96 آبار. قم بتنشيط فرز الفهرس في برنامج فرز FACS لحفظ ملف تعريف مناعي للنوعية لـ CD45RA و CD49F و CD90 لكل خلية مفردة.
فرز بئرين مع 10 و 20 خلية على التوالي لعناصر التحكم الخطية في تضخيم PCR. وعادة ما تستخدم WELLS H1 وH2. احتفظ باثنين من الآبار دون أي خلايا حيث لا يوجد عناصر تحكم في القالب ، وعادة ما تآبار H3 و H4. ختم لوحات مع فيلم لاصق واضح وتدور لوحات في 300 مرة الجاذبية لمدة دقيقة واحدة.
المفاجئة تجميد لوحات على الجليد الجاف. ثم تخزينها في ناقص 80 درجة مئوية. جعل النسخ العكسي ومزيج التضخيم الهدف محددة عن طريق إضافة 632.5 ميكرولترات من مزيج رد فعل مرتين، 101.2 microliters Taq/SuperscriptIII، 151.8 microliters مزيج التمهيدي، و 0.7 microliters ارتفعت في السيطرة RNA.
دوامة الحل وتدور عليه لجمع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب. الحفاظ على مزيج على الجليد حتى يكون جاهزا لإضافتها إلى العينة. بعد ذلك، ذوبان لوحات lysate على الجليد.
إضافة 8.75 ميكرولترات من النسخ العكسي المعدة من قبل ومزيج التضخيم المستهدف المحدد إلى 92 بئرًا ، بما في ذلك الضوابط الخطية وعدم وجود قوالب. إضافة 8.75 ميكرولترات من عدم وجود مزيج التحكم النسخ العكسي إلى الآبار الأربعة المتبقية. ثم ختم لوحات مع فيلم لاصق واضح وتدور لوحات لجمع السائل في الجزء السفلي.
تنفيذ النسخ العكسي والتضخيم الهدف محددة عن طريق تشغيل لوحة في جهاز PCR وفقا لبرنامج preamp. إعداد لوحة تحميل assay عن طريق الأنابيب ثلاثة microliters من مُعَشف تحميل المقايسة إلى كل بئر من لوحة 96-well. إضافة ثلاثة microliters من كل التمهيدي إلى الآبار الفردية في لوحة تحميل المقايسة.
ختم لوحة مع فيلم لاصق وتدور عليه. بعد الغزل لوحة، وإعداد لوحة التخفيف عن طريق الأنابيب ثمانية ميكروليتر من المياه الحرة النوى في جميع الآبار من لوحة 96 جيدا. إضافة اثنين microliters من عينة تضخيمها إلى لوحة التخفيف.
ختم لوحة مع فيلم لاصق. مزيج من خلال دوامة لوحة لمدة 10 ثانية. ثم تدور أسفل لوحة.
المقبل، وإعداد مزيج تحميل العينة عن طريق خلط بعناية 352 ميكرولترات من مزيج رئيسي مع 35.2 ميكرولترات من كاشف تحميل العينة. إعداد لوحة تحميل العينة عن طريق الاقتباس 3.3 ميكرولترات من مزيج التحميل إلى كل بئر من لوحة 96-well. إضافة 2.7 ميكرولترات من العينة المخففة في كل بئر من لوحة تحميل العينة.
ختم لوحة مع فيلم لاصق وتدور عليه. إخراج رقاقة جديدة 96 من قبل 96 microfluidic. إعداد المداخل عن طريق بدس لهم مع حقنة مع قبعة على للتأكد من أنه يمكن نقلها.
إضافة حجم كامل من المحاقن إلى كل صمام في حين إمالة رقاقة إلى 45 درجة والضغط على صمام أسفل. رئيس رقاقة مع وحدة تحكم مؤسسة التمويل الدولية. تحميل كل مدخل مقايسة مع 4.25 ميكرولترات من كل من الآبار في لوحة تحميل المقايسة وتجنب فقاعات.
إذا ظهرت الفقاعات في البئر، قم بإزالتها بطرف ماصة. مواصلة تحميل كل مدخل عينة مع 4.25 ميكرولترات من كل من الآبار في لوحة تحميل العينة، وتجنب فقاعات، وإذا ظهرت فقاعات إزالتها مع طرف ماصة. قم بتحميل الشريحة باستخدام وحدة تحكم الدائرة المتكاملة لـ Fluidics أو وحدة تحكم IFC.
تحقق من أن الرقاقة تبدو حتى وأن جميع الغرف قد تم تحميلها. إزالة الغبار من سطح رقاقة عن طريق لمسها مع الشريط. وأخيرا، تشغيل رقاقة في تعدد microfluidic منصة التعبير الجيني.
خريطة الحرارة من تشغيل ناجحة يعرض التعبير انتشار بالتساوي عبر العينات مع إشارة قوية من حوالي سبعة إلى 25 CTs. هذا منحنى التضخيم من ارتفعت في RNA السيطرة يتحقق من أن جميع الآبار لديها تعبير واضح عن حوالي 10 CT مع القليل من الاختلاف أو أي اختلاف، والتحقق من أن ردود الفعل قبل التضخيم وqPCR كانت ناجحة لجميع الخلايا. يمكن أن يكون تحليل المكون المبدئي أو PCA الذي يتصور أوجه التشابه بين مجموعات الخلايا باستخدام تقليل البعد مفيدًا لتمييز مجموعات الخلايا المتميزة جزيئًا عن بعضها البعض هنا لتحديد أربع مجموعات فرعية.
لتحديد النمط المناعي للخلايا من مجموعات جزيئية مختلفة، قم بتحميل ملف FCS الفهرس في FlowJo. افتح محرر البرنامج النصي ولصق البرنامج النصي الفهرس، اضغط تشغيل. كل خلية ستكون الآن في بوابة منفصلة.
إضافة كل خلية إلى محرر تخطيط ولونها وفقا لتجميع جزيئية المعرفة من SCXV المتاحة في ملف sample_complete_data.xls. تُظهر مخططات FACS تعبير علامة سطح الخلية لعلامات الخلايا الجذعية العاملة في الدم CD90 و CD45RA التي يمكن استخدامها للتمييز بين المجموعات وعزلها للتحليل الوظيفي. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ تقنية أخرى مثل تسلسل الحمض النووي الريبي من الأجناس الفرعية المكتشفة حديثا أو في المختبر وفي التجارب الحية للإجابة على سؤال إضافي مثل ما هي الآلية الجزيئية التي تسبب هذا التغاير وكيف تختلف السكان الفرعية وظيفيا.
وقد مهدت هذه الاستراتيجية الطريق للباحثين ليس فقط للتحقيق في التغايرية في الدم العادي والخبيث، ولكن يمكن استخدامها أيضًا لعزل السكان الفرعيين المكتشفين بشكل مستقبلي لمواصلة دراستها.
