هذه التقنية تجعل من الممكن أن تعطي نظرة فاحصة على الخلايا المفردة في الأنسجة الحية. من خلال تتبع وتلاعب الخلايا الفردية، يمكننا فهم تكوين الأنسجة بشكل أفضل أثناء التطوير. عرض توضيحي مرئي من هذا الأسلوب يمكن المستخدمين المحتملين لتحديد ما إذا كان هذا الأسلوب قد تكون مفيدة لعملهم.
بالإضافة إلى ذلك، فإنه يجعل من الممكن للمستخدمين لمعرفة كيفية تشغيل التطبيق، والتي سيكون من الصعب فهم من النص وحده. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على كل نسيج مع سطح قابل للتقييم. لقد كنا نستهدف خلايا مختلفة في نفس الأنسجة، أنسجة مختلفة في نفس الأنواع، وكذلك أنواع مختلفة.
عند محاولة هذا البروتوكول، من المهم أن تبقى مركزة والعمل بسرعة. يجب أن تكون جميع المعدات على استعداد قبل البدء في تشريح. تبدأ عن طريق تثبيت البرمجيات لصناعة السيارات في الحقن وسحب ماصات الحقن المجهري من الشعيرات الدموية الزجاج borosilicate مع جرة micropipette.
قم بتخزين الماصات لمدة تصل إلى ثلاثة أيام محمية من الغبار. تذوب 3٪ نطاق واسعة agarose باستخدام فرن الميكروويف. لا تدع agarose ترسيخ من خلال الاحتفاظ بها في حمام مائي في 37 درجة مئوية.
ذوبان aliquot A SCM ودافئة 10 إلى 12 ملليلتر سيم و 20 ملليلتر من حل تيرود إلى 37 درجة مئوية باستخدام حمام مائي. خلط التتبع الفلورسنت مع المواد الكيميائية الأخرى التي سيتم حقنها، ثم الطرد المركزي حل الحقن المجهري في 16، 000 مرات G لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. جمع المابير ونقلها إلى أنبوب جديد.
الحفاظ على حل الحقن المجهري على الجليد حتى الاستخدام. استخدم الرؤوس من جنين الماوس E13.5 إلى E16.5 لإعداد شرائح الأنسجة العضوية من التيبينسيفالين. إزالة الجلد وفتح الجمجمة مع ملقط تتحرك على طول خط الوسط.
تشريح الدماغ الجنيني من الجمجمة المفتوحة وإزالة السحايا التي تغطي أنسجة الدماغ بدءا من الجانب البطني من الدماغ. ترك الدماغ كامل تشريح في حل تيرود على كتلة التدفئة 37 درجة مئوية. صب مجموعة واسعة من agarose ذاب في قالب التضمين المتاح.
عندما يبرد إلى 38 إلى 39 درجة مئوية، نقل بعناية تصل إلى أربعة أدمغة في agarose باستخدام ماصة باستور. حرك الأغروزوز حول الأنسجة مع ملعقة أو زوج من ملقط Dumont رقم واحد دون لمس الأنسجة. دع الأاغروز يتوطد في درجة حرارة الغرفة.
بمجرد أن يتوطد agarose ، تقليم الزائدة المحيطة الأنسجة. املأ علبة المخزن المؤقت بـ PBS. توجيه الدماغ مع محور السدودية rostral من النسيج عمودي على علبة وقطع شرائح 250 ميكرومتر باستخدام هزاز.
املأ طبق بيتري 3.5 سنتيمتر مع ملليلترين من وسائل الإعلام الدفء المسبقة، ثم استخدم ماصة باستور البلاستيكية لنقل 10 إلى 15 شريحة إلى هذا الطبق. عند الانتهاء، نقل طبق بيتري مع شرائح في حاضنة ثقافة شريحة. حافظ على الشرائح عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في جو رطب.
قم بتشغيل الكمبيوتر والمجهر وكاميرا المجهر والمتلاعبين وتلاعب الضغط ومستشعر الضغط. تحميل التطبيق عن طريق النقر على الملف، وإطلاق التطبيق.py في المجلد الرئيسي تحميلها من GitHub وتحديد إعدادات الجهاز في الشاشة المنبثقة.
لمنع انسداد غير المرغوب فيها، وخلق ضغط خارجي قبل غمر ماصة في المحلل. قم بتمرير شريط ضغط التعويض إلى 24 إلى 45٪ وانقر فوق قيم مجموعة. بعد ذلك، ضبط الضغط عن طريق تحويل مقبض صمام الضغط الميكانيكي إلى واحد إلى اثنين من PSI كما هو مبين من قبل جهاز استشعار الضغط.
نقل شرائح إلى مركز طبق بيتري 3.5 سنتيمتر تحتوي على ملليلترين من SIM مسبقة التدفئة، ثم ضع طبق بيتري على مرحلة الحقن المجهري التي تم تسخينها مسبقا إلى 37 درجة مئوية. تحميل ماصة الحقن المجهري مع 1.4 إلى 1.6 ميكرولترات من محلول الحقن الدقيق باستخدام ماصة بلاستيكية تلميح طويل وإدراج ماصات الحقن الصغير في حامل الماصات. باستخدام أدنى التكبير على المجهر، وجلب شريحة في التركيز وتوجيه micropipette إلى هذا المجال من الرؤية بحيث يتم التركيز على نفس الطائرة كما الهدف شريحة.
تبديل إخراج المجهر إلى الكاميرا لرؤية FOV والتطبيق. انقر فوق زر التكبير في أعلى يسار الواجهة لبدء معايرة الجهاز. عندما تطالب نافذة بتحديد التكبير، حدد 10X واضغط موافق. البرنامج يفترض عدسة الهدف الداخلي هو 10X.
إعادة تركيز رأس ماصة باستخدام عجلة ميكرومترية من المجهر وانقر على رأس ماصة مع المؤشر. بعد ذلك، اضغط على زر الخطوة 1.1 واضغط على موافق في النافذة المنبثقة. سوف تتحرك الماصة في اتجاه y.
انقر على طرف الماصة واضغط على الزر الخطوة 1.2. وأخيرا، أدخل 45 في مربع زاوية الماصات واضغط على زاوية مجموعة. أدخل المعلمات المطلوبة في لوحة التحكم في الحقن المجهري الآلي وتعيين السرعة إلى 100٪ عند الانتهاء ، انقر فوق قيم مجموعة.
انقر على زر حافة السحب واسحب المؤشر على طول المسار المطلوب في النافذة المنبثقة لتحديد مسار الحقن. بالنسبة للخلايا العصبية الدقيقة، يستهدف الجانب القاعدي من التيتنسفالون. جلب ماصة إلى بداية الخط وانقر على طرفها، ثم انقر فوق مسار تشغيل لبدء microinjecting.
كرر هذه الخطوة لكل طائرة من حقن المستهدفة. تزج شرائح في خليط الكولاجين، ثم نقل شرائح جنبا إلى جنب مع 200 إلى 300 ميكرولترات من الكولاجين في بئر 14 ملليمتر من طبق القاع الزجاجي 35 ملليمتر. تأكد من أن يتم تغطية شرائح في أقل قدر ممكن من الكولاجين، وهو الشرط الأمثل للمواد الغذائية وامتصاص الأوكسجين.
قم بتوجيه الشرائح باستخدام زوجين من ملقط واحتضان طبق بيتري لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية على كتلة تدفئة للسماح للكولاجين بالتوطد. نقل طبق بيتري مرة أخرى إلى حاضنة ثقافة شريحة لمدة 40 دقيقة إضافية، ثم إضافة ملليلتر من SCM قبل تدفئة. في نهاية الثقافة، تأخذ شرائح من الحاضنة ثقافة شريحة وpirspirate المجلس الأعلى للمواد الهتكونية.
اغسل شرائح الكولاجين المضمروسة مع PBS، ثم أضف 4٪ شبه شكلي واترك الأنسجة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. نقله إلى أربع درجات مئوية لتثبيت بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، التعرق حل paraformaldehyde وغسل شرائح مع برنامج تلفزيوني.
إزالة شرائح من الكولاجين باستخدام اثنين من أزواج من ملقط تحت مجهر ستيريو. استخدام الميكروويف لإذابة 3٪ نقطة انصهار agarose منخفضة، ثم صب في قالب التضمين المتاح والسماح لها تبرد إلى ما يقرب من 38 أو 39 درجة مئوية. نقل شرائح الأنسجة في هذا القالب التأكد من أن الجانب قشر من شريحة تواجه ما يصل، ثم السماح agarose لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة وترسيخ.
تقليم agarose اضافية المحيطة شرائح. قم بتوجيه كتلة agarose لضمان أن السطح المقطوع يوازي شفرة القطع في الاهتزاز وقطع 50 ميكرومتر سميكة. ملء طبق 24-well مع برنامج تلفزيوني ونقل المقاطع إلى هذا الطبق باستخدام فرشاة الطلاء غرامة تلميح، ثم أداء مناعيا وفقا للبروتوكولات القياسية.
تظهر هنا صور تمثيلية لخلايا السلف التي تم حقنها بنجاح والخلايا العصبية الوليدة. عندما حقن مع Dextran اليكسا 488، تظهر الخلايا مليئة تماما مع الصبغة. يمكن أن يوفر الحقن الآلي للصغرى إنتاجية أعلى بكثير مقارنة بالجنون الصغير اليدوي.
علاوة على ذلك، يؤكد وضع العلامات EDU أن قابلية الخلية للتطبيق لا تتأثر بالأتمتة. حفظ شريحة organotypic في الثقافة يجعل من الممكن لمتابعة تطور النسب من الخلايا microinjected. الحقن المجهري في الخلايا الجذعية العصبية واحدة يوفر ممتازة دقة خلية واحدة.
ولذلك، فقد تم استخدامه لتشريح بيولوجيا الخلية من تطور الخلايا الجذعية العصبية والانتقال مصير. وقد استخدم هذا البروتوكول لدراسة اقتران تقاطعي في الخلايا العصبية حديثي الولادة عن طريق حقن لوسيفر الأصفر جنبا إلى جنب مع Dextran A555. واقترنا نسبة من الخلايا العصبية الهرمية حديثي الولادة عبر تقاطعات الفجوة إلى الخلايا العصبية المجاورة، وهو ما يتفق مع فكرة أن الخلايا العصبية غير الناضجة التواصل عبر تقاطع الفجوة.
لقد استخدمنا هذه التقنية للتحقيق في بيولوجيا الخلية من نمو الدماغ وتطور الدماغ. درسنا العديد من الجينات المرشحة التي كانت تؤثر على سلوك الخلايا الجذعية العصبية وتمكنا من اكتشاف وفهم كيفية عملها ، وكيف تؤثر على تطور نسب الخلايا الجذعية العصبية ، وإنتاج الخلايا العصبية أثناء نمو الدماغ.
