الهدف العام لهذا البروتوكول هو وصف الإجراءات التي ينطوي عليها إنشاء أعراض, نموذج الماوس الدوائية للDYT/PARK-ATP1A3 خلل التوتر باستخدام cannulas الدماغ في مضخات التناضح وحفز الإجهاد عن طريق المهام الحركية الصعبة. هذه الطريقة تفاصيل كيفية إنشاء نموذج الماوس الدوائية باستخدام تسليم المخدرات المزمنة عن طريق مضخات تناضحة إلى cannulas الدماغ متعددة وكيفية الحث على النمط الظاهري عن طريق المهام الحركية الصعبة. كما يوفر نموذج الإجهاد الحركي المعتدل رؤى حول دور التفاعلات الجينية والبيئية في اضطرابات الحركة، ويمكن تطبيقه على نماذج القوارض الأخرى.
أجريت التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الوطنية والمؤسسية المعمول بها لرعاية الحيوانات واستخدامها. تبدأ من خلال إعداد مضخات التناضح في بيئة معقمة. أولا، ملء حقنة ملليلتر واحد مع 27 قنية تعبئة قياس مع محلول ouabain مصفى معقمة أو حل السيارة.
عقد مضخة التناضح في وضع تستقيم، إدراج كانولا على طول الطريق في المضخة وملء الخزان ببطء حتى يظهر حل الزائدة على القمة. بعد ذلك، أدخل مشرف التدفق في المضخة. اخلع بعناية شفة بيضاء من تدفق مشرف مع مقص وربط قطعة من أنابيب الفينيل إلى وسيط تدفق.
غمر كل مضخة في أنابيب Eppendorf مليئة في منتصف الطريق مع محلول ملحي ووضعها في ثيرموسيل 37 درجة من أجل ضمان أن معدل الضخ يصل إلى حالة ثابتة قبل بدء الجراحة. بعد تخدير الحيوان بعمق وفقًا للبروتوكولات المعتمدة ، ضع الحيوان في إطار مجسم وإصلاح الرأس باستخدام نصائح مطاطية أو قضبان الأذن غير الممزقة. بعد التطهير الشامل للمنطقة الجراحية ، استخدم مشرطًا لوضع شق في أعلى الرأس واستخدام المقص لمواصلة الشق وصولاً إلى أطرافه.
فضح الجمجمة بمساعدة المشابك البلدغ ومسح periosteum مع قضيب القطن معقمة. محاذاة إما قلم أو غيض من قنينة ملطخة بالحبر الأسود مع bregma واستخدام الإحداثيات المناسبة للاحتفال نقاط الدخول الثلاث لقنيات الدماغ على الجمجمة. المقبل، بعناية حفر الثقوب لالقنية مزدوجة المعينة لال ganglia القاعدية وقنية واحدة مخصصة لخيخة المخيخ.
حفر حفرة رابعة لملغي صغير بين المخطط والمخيخ. هذا المسمار في نهاية المطاف أن تكون جزءا لا يتجزأ من الاسمنت الأسنان وتوفير عقد إضافية لقنية. من أجل إنشاء جيب صغير للمضخة التناضحة على كل جانب من الحيوانات مرة أخرى، واستخدام ملقط الأنسجة لفصل طبقات الأنسجة تحت الجلد.
تقدم ملقط نحو ساق واحدة الخلفية وفتح ملقط قليلا من أجل توسيع الجيب تحت الجلد. كرر نفس الإجراء للجانب الآخر، أولا إزالة ملقط من شق ثم دفعها بلطف نحو الساق الخلفية الثانية. مع مساعدة من ملقط، أدخل بعناية المضخات والقسطرة المتصلة في كل جيب تحت الجلد.
وينبغي أن تسمح الجيب مضخة لشريحة بسهولة في. باستخدام حامل مضخة صغيرة، إدخال كانية ونسمة واحدة مع طول مخصص من 3.0 ملليمتر في حفرة حفرت في خط الوسط من المخيخ. فصل رئيس كانولا بعناية وإصلاح كانولا وكذلك المسمار الصغيرة مع الاسمنت الأسنان، مع الحرص على عدم تغطية قطعة ربط لأنابيب مضخة التناضح.
تأكد من أن الأسمنت طبيب الأسنان المحيطة cannula قد جفت تماما قبل الاستمرار في عملية جراحية. قبل إدخال القنية المزدوجة في الثقوب التي تم حفرها ثنائيًا فوق العقدة القاعدية ، نعلق قطعتين طويلتين من أنابيب الفينيل 0.5 سنتيمترًا إلى قطعتي ربط القنب المزدوجتين. قم بتوصيل أنابيب الفينيل بمحول تشعب وملء نظام الأنابيب بالكامل بعناية مع محلول أوابيين معقمة.
بعد ذلك، كرر نفس الخطوات كما هو موضح سابقا لقنية واحدة ونهاية عن طريق تحديد قنية مزدوجة مع أسمنت الأسنان. قم بتوصيل القسطرة من المضخات التناضحة إلى محول التشعب بالإضافة إلى قنية واحدة على التوالي. كلا مضخات لديها معدل تدفق متساو لذلك يجب الحرص على ربط مضخة التناضح مع حل مركزة مزدوجة لمحول التشعب لضمان أن نفس التركيز يصل إلى كل من العقد القاعدية و المخيخ.
أغلق الشق على الجزء الخلفي من الحيوانات مع غرز قدر الإمكان دون الإفراط في الجلد. حقن تحت الجلد المالحة المعقمة، والتي ينبغي أن يكون درجة حرارة الجسم لتجنب الجفاف. إزالة الحيوان من إطار stereotactic وضعه في قفص الانتعاش.
من أجل الحث على حركات تشبه خلل التوتر ، يجب أن تتعرض الفئران التي تم تطعيمها ouabain إلى المهام الحركية الصعبة كنموذج إجهاد معتدل بعد أربع ساعات من الجراحة وبشكل متكرر كل 24 ساعة بعد ذلك. وهذا لا يشمل توصيف السلوك للحيوانات. نُظهر هنا مثال مُندمج في السيارة، يتم وضعه على عمود خشبي خشن طوله 50 سنتيمترًا، ويواجه الأنفه لأسفل.
توفير ما يكفي من الفراش في قاعدة القطب في حالة السقوط. بالنسبة للفئران التي تم تطعيمها في الوابين، يجب أن تبدأ الحيوانات في تقديم الأعراض الأولى مثل براديكينيزيا بعد أربع ساعات من الجراحة. ومع ذلك، بعد 24 ساعة من الجراحة، يجب أن تشاهد فرط الإفراط اللاإرادي للأطراف الأمامية أو الخلفية كعلامة على حركات تشبه خلل التوتر أثناء النسب.
يجب أن تنزل الفئران القطب ثلاث مرات ، والسماح لمدة دقيقتين على الأقل من الانتعاش بين كل هبوط. ولا يحتاج وقت الهبوط إلى القياس. وينبغي أن يتبع اختبار القطب من قبل مهمة محرك الثاني، وذلك باستخدام قضيب الدورية.
كما فعلت لاختبار أداء Rotarod، يتم وضع الفئران ouabain والمركبات من مجموعات الإجهاد على قضيب الدورية. لا يحتاج زمن الوقوع إلى القياس. كما هو الحال بالنسبة للاختبار السابق ، يجب وضع الفئران على قضيب الدورية ثلاث مرات ، مما يسمح دقيقتين من الانتعاش في الفترة الفاصلة بين أشواط.
يمكن استخدام مقياس تصنيف خلل التوتر المعدل لتقييم تردد وشدة وتوزيع الجسم للحركات الشبيهة بخلل التوتر للفئران. يجب وضع الحيوانات في صندوق بلاستيكي أو خشبي ويجب تسجيل الحركات لفترة زمنية مدتها أربع دقائق. يجب أن يكون عاملي التقييم أعمى عن تعيين المجموعة.
الحركات أو المواقف التي تعتبر مثل خلل التوتر هي فرط الإفراط في الأطراف الأمامية، موقف واسع، أو فرط اتساع الأطراف الخلفية، وكذلك الحدب. إذا تأثر جزء واحد فقط من الجسم، ينبغي اعتبار خلل التوتر البؤري. إذا تأثر الجذع واثنين على الأقل من أجزاء الجسم الأخرى، يجب أن يعتبر خلل التوتر معممة.
نظام تسجيل ثان تم تطويره حديثًا من صفر إلى ثماني نقاط ، يقيم وجود وشدة الحركات الشبيهة بخلل التوتر أثناء اختبار تعليق الذيل. للاختبار، عقد الماوس من قبل الذيل بالقرب من قاعدته لمدة دقيقتين. من المستحسن تسجيل اختبار تعليق الذيل وتعيين درجة للتحليل اللاحق لللقطات.
يتم تسجيل الأطراف الأمامية من صفر إلى أربع نقاط. يتم تسجيل التراجع المتكرر أو المستمر منشط واحد من كلا الأطراف الأمامية، فضلا عن فرط الإفراط جنبا إلى جنب مع عبور الأطراف الأمامية كما خلل التوتر مثل. يتم تسجيل حركات تشبه خلل التوتر في الأطراف الخلفية ، مما يعني التراجع والانقباض ، بالإضافة إلى فرط الإفراط المستمر ، من صفر إلى ثلاث نقاط.
يتم تسجيل تشويه truncal الحالية أكثر من 80٪ من الوقت المسجل مع نقطة إضافية. المشبك في الأطراف الخلفية هو علامة غير محددة للضعف الحركي ولا ينبغي أن يسجل. يوضح هذا الرسم البياني نتائج مقياس تصنيف خلل التوتر.
الفئران وشدد ouabain perfused تقدم حركات أكثر بكثير مثل خلل التوتر على مدى فترة المراقبة من 72 ساعة من مجموعة الوابين غير الإجهاد perabain، فضلا عن السيارة. هذه الصورة تصور النتائج من اختبار تعليق الذيل ويظهر نتيجة مماثلة لمقياس تصنيف خلل التوتر. لاحظ أن نتائج المتوسط من مجموع نقاط كل لكل نقطة زمنية.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية زرع قنية الدماغ متعددة بشكل مجسم وكيفية زرع مضخات التناضح تحت الجلد. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنه يمكن تجنب الحقن المتكررة والمجهدة وأن الركيزة مثل الوبين ، والتي لولا ذلك يمكن أن يكون لها آثار جانبية على نطاق المنظومة يمكن تسليمها مباشرة إلى هياكل محددة في الدماغ.
