التصوير الآلي هو تقنية قوية وبسيطة لدراسة توزيع مواقع ربط البروتين في الأنسجة باستخدام الراديوغند المحدد للهدف. كما أنها بديل مناسب للكيمياء المناعية. هذه التقنية تصور التعبير البروتين مع القرار المكاني عبر الصور الرقمية التي هي أسرع من التعرض للفيلم التقليدي.
ويمكن أيضا أن تستخدم للتحليل الدوائية من أهداف البروتين. وتنطوي هذه الطريقة على أنسجة الماوس التي شنت على الزجاج ولكن يمكن تمديدها إلى أنواع أخرى أو حتى إلى الخلايا التي تزرع على الأغطية. إثبات الإجراء سيكون من قبل نان غريم كراي، طالب دكتوراه في مختبري.
للبدء، غمر الأنسجة في مسحوق الجليد الجاف لتجميده. نقل الأنسجة المجمدة مباشرة إلى التبريد الذي تم تعيينه إلى ناقص 20 درجة مئوية. اسمحوا الأنسجة تتأقلم إلى ناقص 20 درجة مئوية في التبريد لمدة 20 دقيقة.
ثم تغطية حامل الأنسجة مع تضمين المتوسطة خارج التبريد ووضع بسرعة عينة الأنسجة المجمدة في الاتجاه المطلوب في حين أن المتوسطة embedding لا يزال السائل. نقل حامل الأنسجة مرة أخرى إلى التبريد وفضح المتوسطة تضمين لدرجات حرارة أقل من ناقص 10 درجة مئوية لتصلب. ضع حامل الأنسجة في الدقيقة من التبريد.
ضبط اتجاه الأنسجة لتجنب المقاطع المنحدرة. قطع الأنسجة مع توجيه من أطلس stereotaxic في أقسام من سمك المطلوب وتتكشف القسم مع فرشاة صغيرة إذا لزم الأمر. ذوبان جبل القسم على شريحة المجهر.
ثم جمع تسلسليا المقاطع من المنطقة ذات الأهمية للتكرار التقني المطلوب. السماح لأقسام على الشرائح لتجف الهواء لمدة ساعة واحدة قبل مزيد من التعامل معها. في مختبر النشاط الإشعاعي المعتمد، استخدم قلم رصاص لتسمية الشرائح بالظروف التجريبية.
ضع الشرائح أفقيًا في الصواني البلاستيكية. تطبيق وحدة تخزين مناسبة من المخزن المؤقت SA تعديل إلى الهدف في السؤال إلى المقاطع المحملة على الشرائح. تأكد من أن كل قسم مغطى بالكامل.
لتحديد الربط غير المحدد، ملحق SA العازلة مع تركيز ذات الصلة من مركب غير يسمى. ثم تغطية الصواني مع الأغطية لتجنب التبخر. قبل احتضان في درجة حرارة ذات الصلة لمدة 30 دقيقة على لوحة شاكر تعيين إلى 20 دورة في الدقيقة.
بعد ذلك، قم بسكب سائل ما قبل الحضانة من كل شريحة ونقل الشرائح مرة أخرى إلى صينية بلاستيكية. تغطية على الفور أقسام تماما مع تركيز ذات الصلة من radioligand في SA العازلة. لتحديد غير محددة ملزمة، تكملة حل الligand radioligand مع تركيز ذات الصلة من مركب غير محدد.
غطي الصواني بالأغطية وتجني تحت الظروف المرغوبة مع اهتزاز خفيف مستمر عند 20 دورة في الدقيقة. بعد ذلك، صب قبالة حل الحضانة ونقل الشرائح إلى رف شريحة المجهر. غسل الشرائح على الفور.
بالنسبة لبروتوكول GHB، اغسل مرتين بمخزن SA بارد للثلج لمدة 20 ثانية ثم شطف مرتين عن طريق غمس رف الشريحة في صواني مملوءة بالماء المقطر البارد المثلج. ضع الشرائح عموديًا في الرفوف وتجف الهواء لمدة ساعة واحدة على الأقل. ثم نقل الشرائح إلى المثبت يحتوي على paraformaldehyde لتثبيت بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
في اليوم التالي، نقل الشرائح إلى مربع مجفف يحتوي على هلام السيليكا في درجة حرارة الغرفة. اترك الشرائح في مربع القضيّات لمدة ثلاث ساعات للقضاء على الرطوبة. أولاً، ضع المقاطع في لوحة تصوير محمية بالإشعاع مع مواجهة الأنسجة لأعلى.
إدراج مقياس صغير مشع في كل كاسيت من أجل التحديد الكمي اللاحق للربط في علم الشرائط الإشعاعية. قبل الاستخدام مباشرة، قم بتحميل لوحة التصوير الفوسفورية الحساسة التريتيوم في آلة التصوير الفوسفوري وتعريضها لضوء الأشعة تحت الحمراء المرئية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لمحوه. ثم قم بإزالة لوحة التصوير من آلة التصوير الفوسفورية ووضعها على الفور على الأقسام في الكاسيت.
تأكد من أن الكاسيت مغلق تماماً. عرض المقاطع لصفيحة التصوير الفوسفوري للحصول على وقت التعرض الأمثل في درجة حرارة الغرفة بينما تكون محمية من الضوء. بعد التعرض، قم بفتح الكاسيت بعناية في الظلام ونقل لوحة التصوير على الفور إلى الصندوق المظلم لصورة الفوسفور.
مسح لوحة في أعلى دقة ممكنة للحصول على صورة رقمية. للبدء، افتح برنامج تحليل الصور المناسب. حدد الكثافة البصرية النسبية لكل معيار معايرة عن طريق تحديد منطقة عنصر القائمة.
حدد أداة إنشاء المنطقة واستخدامها لتحديد منطقة متساوية الحجم لكل نقطة من المقياس الصغير المشع. تعيين رقم لكل منطقة محددة بالنقر فوق الرقم تحت تسمية عنصر القائمة. انقر فوق تصدير الملف ثم تقرير المنطقة 2D لتصدير قيم OD لكل نقطة من معيار المعايرة.
في برامج التصوير الخاصة، استخدم أداة إنشاء منطقة لتحديد المنطقة ذات الاهتمام في كل قسم وقياس لديها ODs لبدء تنفيذ القياس الكمي للوراميات. حدد نفس المنطقة في كل قسم عن طريق إنشاء قالب لمنطقة الاهتمام ونسخه وضبطه مع الاختلافات الطفيفة في تشريح الدماغ في كل مخطط تلقائي. بعد ذلك، انقر فوق تقرير منطقة تصدير الملف 2D لتصدير قيم ROD وأحجام المناطق المحددة في جدول بيانات.
تحديد ربط من الligand radioligand كما هو موضح في بروتوكول النص. في هذه الدراسة، يتم تصور التوزيع التشريحي لـ مواقع الربط GHB عالية التقارب مع GHB المشعة التناظرية HOCPCA في الدماغ الماوس الذي تم قطعه إلى أقسام الإكلالي، القوس، والأفقي. وينظر إلى مستويات عالية من الربط في قرن آمون والقشرة في حين ينظر إلى مستويات الربط أقل في المخطط ويتم الكشف عن أي ربط في المخيخ.
كما هو مبين هنا، يمكن تصور الهياكل التشريحية باستخدام طائرات مختلفة ويمكن دعم سلامة التشريحية من قبل تلطيخ البنفسج الكريسيل. توضح الصور التلقائية التمثيلية الجرذان والفأر والخنزير الحفظ التطوري لمواقع الربط GHB العالية في الدماغ الثديي. يتم الكشف عن مواقع الربط هتكينغ المشعة في جميع الأنواع الثلاثة مما يتيح مقارنة تشريح الدماغ الإجمالي بينهما.
يتم بحث مواقع الربط GHB عالية التقارب مع الأقليات الإشعاعية GHB التي تظهر تقاربات مختلفة لمواقع ملزمة ولكن أنشطة محددة قابلة للمقارنة. وهبت HOCPCA المشعة مع حساسية عالية وإشارة ممتازة إلى نسبة الضوضاء. ونظراً لانخفاض حساسية NCS-382 المشعة، يجب استخدام تركيزات أعلى من الغرزة الإشعاعية من أجل الحصول على مستويات مماثلة من الربط.
بل إن التركيزات الأعلى في الغرابات الإشعاعية ضرورية للتوصل إلى مستويات ربط مماثلة. ومع ذلك، فإن التركيزات العالية في الغرزية الإشعاعية تزيد أيضاً من مستوى الربط غير المحدد، وبالتالي تنخفض نسبة الإشارة إلى الضوضاء. من المهم تحسين ظروف الفحص مثل تركيز الألواح الإشعاعية ، والغسيل ووقت التعرض من أجل الحصول على أفضل إشارة إلى نسب الضوضاء ، ومن المهم جدًا أيضًا أن تتذكر أن تتذكر أن تمحو اللوحة من قبل.
ويمكن توسيع هذا الإجراء إلى الظروف في الجسم الحي للحصول على فكرة عن مجمع ملزم في حي والتي يمكن أن تكون مفيدة لمشاريع اكتشاف. تذكر أن تعمل في مختبر مع مواد مشعة كاملة معتمدة وأن ترتدي ملابس واقية عند التعامل مع النشاط الإشعاعي أو شبه شكلي.
