خلايا الكبد الأولية للفئران مهمة في دراسات الكبد. خاصة بالنسبة لاستقلاب الجلوكوز ، واختبار الأدوية الكبدية. من ناحية الوقت ، يمكن أن تستغرق عملية العزل وقتا طويلا وتكلف الطاقة.
يمكن أن يوفر هذا البروتوكول طريقة فعالة لعزل خلايا الكبد الأولية للفأر. إنه الوقت وسهولة العمل. يتطلب خطوات قليلة جدا مع جميع المناطق المتاحة تجاريا.
ابدأ باستخدام المضخة التمعجية لبدء ضخ الماء المقطر المزدوج الدافئ بسرعة 4 مل في الدقيقة ، لمدة خمس دقائق. ثم قم بتغيير أنبوب الضخ من الماء إلى وسط التروية الساخن. مراقبة فقاعة الهواء بين الماء ووسط التروية.
سوف يساعد على تتبع تدفق وسط التروية من خلال النظام. بعد ذلك تطهير البطن من مخدر ثمانية أسابيع C57 أسود 6J أنثى الفأر مع 70 ٪ من الإيثانول. وباستخدام مقص ، قم بقطع البطن لكشف الكبد والوريد البابي والوريد الأجوف السفلي.
ثم أوقف المضخة التمعجية. بعد التأكد من أن أنبوب الضخ يحتوي على وسط التروية وليس الماء. أدخل قسطرة قياس 24 في الوريد الأجوف السفلي.
قم بتشغيل المضخة مرة أخرى وقم بفتح الوريد البابي. أثناء ضخ وسط التروية ، اضغط على الوريد البابي كل دقيقة للسماح للسائل بالوصول إلى كل ركن من أركان الكبد. استمر في الضخ لمدة ثلاث إلى خمس دقائق تقريبا أو حتى يصبح السائل الذي تم تنظيفه صافيا.
بعد ذلك قم بتغيير أنبوب الضخ من وسط التروية إلى وسط توزيع الكولاجيناز. واضغط على الوريد البابي كل دقيقة للسماح للسائل بالوصول إلى كل ركن من أركان الكبد. استمر في الضخ حتى يتم استنفاد كل 25 مل من وسط إزالة الكولاجيناز.
بعد ذلك عزل الكبد كله دون المرارة. ووضعها في 30 مل من وسط الغسيل في طبق بتري على الثلج. باستخدام ملقط تمزيق الكبد إلى قطع لإطلاق خلايا الكبد الأولية في المحلول.
في هذه المرحلة ، يتحول وسط الغسيل إلى محلول غائم يحتوي على خلايا الكبد الأولية التي تم إطلاقها وقطع الكبد الصغيرة. قم بتصفية هذا الحل الغائم من خلال مصفاة خلايا 70 ميكرون ، إلى 20 مل من 1X لكل مكالمة HBSS في أنبوب 50 مل على الجليد. وامزج المحلول عن طريق عكس الأنبوب 20 مرة.
التالي الطرد المركزي الحل. ثم في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة ، شفط supernatant. واغسل الكريات ب 30 مل من وسط الغسيل البارد.
بيليه الخلايا مرة أخرى مع الطرد المركزي. قم بإزالة السوبرناتانت ، وأعد تعليق الكريات في 25 مل من وسط الثقافة. عد الخلايا وطبقها على لوحات الثقافة المطلوبة.
وفقا للتصميم التجريبي. بعد الطلاء ، تم ربط خلايا الكبد الأولية المعزولة بقوة لمدة ساعة واحدة وتوسعت بالكامل بعد 12 ساعة. في خلايا الكبد المعزولة ، زادت مستويات mRNA من علامات خلايا الكبد ، مثل transthyretin و CD95 و ASGR1 و ASGR2 بشكل كبير مقارنة بالكبد بأكمله.
على النقيض من ذلك ، كان وجود الخلايا المناعية والخلايا النجمية والخلايا البطانية أقل. كما يتضح من الانخفاض الحاد في CD45 ، الكولاجين من النوع 1 ألفا 1 ، والخلية البطانية 2 كيناز 2 مستويات الحمض النووي الريبوزي المرسال. مما يشير إلى أن هذا البروتوكول يمكن أن يقلل بشكل كبير من التداخل من الخلايا الكبدية الأخرى.
بعد طلاء مستويات ASGR1 و ASGR2 انخفضت مع مرور الوقت ، ولكن تبقى قابلة للمقارنة مع الكبد بأكمله حتى نقطة زمنية مدتها 12 ساعة. خاصة بالنسبة ل ASGR1. كان مستوى التعبير عن CD81 المرتبط بالغشاء ثابتا لمدة تصل إلى 48 ساعة.
وبالمقارنة، زاد تعبير المستقبلات الشبيهة بالرسوم 4 بشكل عام وأصبح أعلى مما كان عليه في مستويات الجسم الحي بعد 48 ساعة. أظهرت اختبارات حساسية الأنسولين أن الأنسولين عزز بشكل كبير الفسفرة لكل من AKT في سيرين 473. وصندوق رأس الشوكة 01 في سيرين 256 ، في خلايا الكبد.
الإشارة إلى حساسية خلايا الكبد الأولية للأنسولين. زادت مستويات بروتين فوسفونولبيروفات كاربوكسيكيناز بشكل كبير بعد علاج الجلوكاجون. مما يشير إلى أنه تم تنشيط مسار إنتاج الجلوكوز.
تم تأكيد هذا التنشيط بشكل أكبر من خلال زيادة إنتاج الجلوكوز. ومع محفزات إنتاج الجلوكوز الأخرى مثل Forskolin + IBMX. يمكن لهذا البروتوكول توفير الوقت والطاقة للدراسات التي تستخدم خلايا الكبد الأولية للماوس.
باتباع هذا البروتوكول ، يمكن إجراء التجارب ذات الصلة مثل استقلاب الجلوكوز الافتراضي واختبارات المؤشرات الحيوية الصيدلانية.
