هذا البروتوكول يسهل العزلة والثقافة استنساخها على المدى الطويل من خلايا الكبد الماوس في بيئة شطيرة الكولاجين 3D لدراسة تشكيل الهيكل الكنسي واستجابتها للعلاج في المختبر. مرة واحدة وقد تم إتقان هذه التقنية، انها طريقة سريعة للحصول على كميات كبيرة من السكان الكبدية الماوس قابلة للحياة للغاية ونقية لدراسات في المختبر. إثبات الإجراء سيكون لينكا سارنوفا، فني من مختبرنا.
في اليوم السابق لعزل الكبد الأولية، أضف 100 ميكرولترات من 10X DMEM، 485 ميكرولترات من الماء المقطر، و 15 ميكرولترات من هيدروكسيد الصوديوم الضرس في 500 ميكرولترات إلى الكولاجين ذيل الفئران واحد. تحقق من الـ PH للكولاجين الذي تم تحييده. يجب أن يكون حوالي 7.5.
باستخدام ما قبل المبردة 200 ميكرولتر ماصات تلميح، انتشار 100 ميكرولترات من حل الكولاجين تحييد على كل من البلاستيك 3.5 أطباق الثقافة قطرها سنتيمترات على الجليد ووضع الأطباق تحت ظروف الثقافة القياسية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، اُعاد هيدرات طبقات الكولاجين بميليلتر واحد من 37 درجة مئوية في كل طبق لمدة ثلاث ساعات على الأقل عند 37 درجة مئوية. لعزل الكبد، بعد التأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع و أسفل، ضع الماوس المُخفّق على حصيرة تشريح في موضع الزى وشريط الأطراف السفلية والعليا على الحصيرة.
مسحة البطن مع الإيثانول 70٪ وجعل شق على شكل حرف V من منطقة العانة إلى كل forelimb. أضعاف الجلد على الصدر للكشف عن تجويف البطن ووضع حصيرة تحت المجهر تشريح. نقل الأمعاء الدقيقة والقولون في اتجاه السد لفضح IVC وتحميل حقنة ملليلتر اثنين مع 2.5 ملليلتر من 37 درجة مئوية حل C.Connect الحقنة إلى القنية واستخدام مسحة القطن غارقة PBS للضغط على الكبد تصل إلى الحجاب الحاجز.
ضع خياطة غارقة حول IVC أسفل الكبد مباشرة. ثم باستخدام حقنة الأنسولين مجهزة بإبرة قياس 30 عازمة إلى زاوية 45 درجة، حقن 10 ميكرولترات من 5،000 وحدة لكل ملليلتر من الهيبارين في الوريد المدخل. لقن الكبد، استخدم مقص microsurgical لجعل شق صغير في IVC مباشرة بجوار الكبد وأدخل كانولا في شق.
تأمين القنية في مكان مع الغرز وعقدتين الجراحية وقطع الوريد المدخل للسماح للمخازن الضخ بالتدفق من الكبد. ثم الاكتئاب ببطء المكبس حقنة لإغراق الكبد مع مليلترين من الحل على مدى فترة من حوالي 15 ثانية. عندما تم تسليم كل من الحل، قبل ملء مضخة ال peristaltic مع حل درجة مئوية جديدة 37 C والتحقق من جهاز النفخ لضمان عدم وجود فقاعات الهواء في النظام.
قطع بعناية كانولا من الحقنة وبسرعة ولكن بعناية ربط أنابيب مضخة العلومة تشغيل إلى القنية. بدء فورا في الضخ بمعدل تدفق 2.5 ملليلتر في الدقيقة. بعد دقيقتين، قم بالتبديل إلى الحل D ومتابعة perfusion لمدة 10 دقائق إضافية.
في نهاية الضخ ، قم بحصاد الكبد بعناية في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر يحتوي على 20 ملليلتر من محلول 37 درجة مئوية E.To عزل خلايا الكبد الأولية ، وعقد الكبد عن طريق القنب ، وفرك الأنسجة حول جدار الأنبوب لضرب خلايا الكبد في المخزن المؤقت. عندما تم هرس جميع الأنسجة، نقل ملاط الأنسجة إلى مصفاة نايلون مسام 70 ميكرومتر لتصفية الخلايا المعزولة في أنبوب جديد 50 ملليلتر. رواسب خلايا الكبد عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في 20 ملليلتر من 40٪ Percoll في DMEM.
فصل الخلايا الحية والميتة عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في 20 ملليلتر من الحل E.After الطرد المركزي للخلايا مرة أخرى، resuspend بيليه في 10 ملليلتر من حل جديد E للعد. بعد العد، ضبط عدد الكبد الأساسي إلى 3.75 مرات 10 إلى الخلايا القابلة للحياة خمس لكل ملليلتر من الوسط ثقافة الكبد. لثقافة خلايا الكبد الأولية المعزولة في سندويشات الكولاجين ثلاثية الأبعاد ، استخدم ماصة ملليلتر واحدة لتوزيع ميليلترين من الخلايا بالتساوي على كل طبق قطره 3.5 سنتيمتر مغطى بالكولاجين.
وضع الخلايا في الحاضنة ثقافة الخلية لمدة ثلاث ساعات. أثناء الحضانة، وإعداد 100 ميكرولتررس من الكولاجين ذيل الفئران تحييد حل واحد لكل طبق كما هو موضح. في نهاية الحضانة، بعناية استبدال الخلايا المتوسطة وغير المرتبطة مع 100 ميكرولترات من الكولاجين تحييد كل طبق وإعادة لوحات إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة ساعة.
عندما يكون الكولاجين قد توطدت، تضاف بعناية مليلترين من الاستزراع الكبدي الطازج المتوسط لكل طبق وإعادة الثقافات إلى الحاضنة لمدة ثلاثة إلى ثمانية أيام التحقق من الثقافات يوميا تحت المجهر. للحصول على تسمية مناعية من الكبدات الأولية داخل سندويشات الكولاجين 3D، وغسل كل شطيرة بعناية مع 37 درجة مئوية PBS وإصلاح الثقافات مع ملليلتر واحد من 4٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني لكل طبق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية التثبيت، وغسل الأطباق ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في مليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني تكملها 0.1٪ توين 20 لكل غسل.
بعد الغسيل الأخير، permeabilize الخلايا مع ملليلتر واحد من 0.1 الجلايسين المولر و 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة تليها ثلاثة يغسل في برنامج تلفزيوني زائد توين 20 كما أظهرت للتو. المقبل, استخدام 10 طرف تحميل ميكروليتر متصلة فراغ لإزعاج بلطف الطبقة العليا من الكولاجين ومنع أي ربط غير محدد مع ملليلتر واحد من 5٪ البوم مصل البقر في برنامج تلفزيوني توين لمدة ساعتين. في نهاية الحضانة، إضافة الأجسام المضادة الأولية من الفائدة المخففة في حل منع لكل طبق واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
في صباح اليوم التالي، وغسل الأطباق مع ثلاثة يغسل 15 دقيقة في برنامج تلفزيوني توين تليها وضع العلامات مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة في 37 درجة مئوية لمدة خمس ساعات. في نهاية الحضانة، وغسل الثقافات مرتين مع برنامج تلفزيوني توين ومرات واحدة مع الماء المقطر كما هو موضح قبل تركيب الطبق مع مضادة تتلاشى تصاعد المتوسطة للمجهر. في غضون يوم واحد من البذر في سندويشات الكولاجين 3D، شكلت الكاسات الكبدية الأولية الماوس مجموعات ومنظمة ذاتيا في شبكة منتظمة تقريبا من القناة الصفراوية.
في غضون ثلاثة إلى ستة أيام، عادة ما يتم ملاحظة مجموعات من خمس إلى 10 خلايا مع خلايا الكبد المستقطبة بالكامل التي تشكل شبكة canalicular. العلاج إما مع السموم أو cytoskeleton- تغيير المخدرات النتائج في تغييرات في الهيكل السينتوسيت والصفراء canaliculi العرض والشكل والعدد. على الرغم من أن علاج الإيثانول يسلك تأثير خفيف فقط على تنظيم الكيراتين 8 ، فإنه يزيد من التورتوسية وتوزيع الاعراض القناةية الصفراوية.
يتم تقليل كثافة الإشارة من تلوّط ZO-1 في البيلات المعالجة بالإيثانول canaliculi مقارنة مع الضوابط غير المعالجة مما يشير إلى فقدان تقاطعات النوع بعد العلاج بالإيثانول. تثبيط actomyosin مع Blebbistatin يحفز على تشكيل غير منظم ، سميكة ، مدورة bile canaliculi. بالإضافة إلى ذلك، العلاج بحمض أوكادايك يمنع الفوسفاتاتاتية التي تؤثر بقوة على الخصائص الفيزيائية للكيراتينات مما يؤدي إلى القناة الصفراوية التي تضيق بشكل كبير مقارنة بالضوابط غير المعالجة.
وعلاوة على ذلك، علاج الإيثانول يرفع بشكل كبير من مستويات كل من ألانين وaspartate نقلات الأمينية مما يشير إلى إصابة الكبد الحادة في حين أن العلاج Blebbistatin لا يؤدي إلى أي تغييرات في الاعتبار في مستويات الترانساميناز وحامض okadaic يسبب تغييرات كيميائية حيوية خفيفة في الأمينات الأمينية ألانين ولكن لا تغيير في التعبير أمينترانسفيراز الأسبارتات. من المهم أن تستمر في العمل بسرعة نسبيا خلال التكبل وفي بداية القذف وتجنب فقاعات دخول نظام القذف. ويمكن جمع الخلايا في آبار مكررة للبروتينات ذات الأهمية لتحديد ما إذا كانت التغيرات في التعبير عن البروتين و/ أو مراحل التنشيط تحدث أثناء العلاج.
