الميتوكوندريا هي العضيات الأساسية للخلايا eukaryotic قادرة على التنفس الهوائية. خللهم الوظيفي هو مصدر معروف للأمراض البشرية. بيكر الخميرة الميتوكوندريا يحتوي على الجينوم الدائري ترميز ثمانية بروتينات.
في هذا الفيديو، وصفنا البروتوكول المستخدم في فحص التمثيل الحيوي للبروتين في الميتوكوندريا الخميرة عن طريق وضع العلامات المشعة للمنتجات التحويلية والفصل اللاحق عن طريق إلكتروفورسيس هلام. يتضمن الإجراء عدة خطوات رئيسية. خميرة متتالية من ثقافات الأسهم المجمدة على لوحات طازجة مع المتوسط المناسب.
وضع لوحات في حاضنة الثقافة في 30 درجة لمدة 24 إلى 48 ساعة. تلقيح هذه الثقافات في اثنين من ملليلتر من المتوسط من خط جديد في أنبوب 15 ملليلتر واحتضان لهم بين عشية وضحاها التحريض في 200 دورة في الدقيقة في 30 درجة. قياس الكثافة البصرية للثقافة عند الطول الموجي ل 600 نانومتر.
تأخذ حجم المقابلة لوحدات امتصاص 0.2 في أنابيب معقمة لوحة خلايا الخميرة في 9, 000 G لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. تجاهل هذا العملاق. غسل الخلايا مع 0.5 ملليلتر من الماء العقيم عن طريق الدوامة لمدة خمس ثوان.
خلايا الخميرة Pallette في 9، 000 G لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. تجاهل الناتنات الفائق. تمييع الخلايا في اثنين من ملليلتر من مسح الطازجة agar المتوسطة.
حافة الحضانة التي اتخذت في 200 دورة في الدقيقة و 30 درجة حتى تصل الكثافة البصرية من 1.5 إلى 1.9 من 1.5 إلى 1.9 القيم. نقل حجم الثقافة المكافئ لوحدة بصرية واحدة في أنبوب الطرد المركزي الصغير. تدور الأنابيب في 3000 غرام لمدة دقيقة واحدة.
تجاهل الناتنات الفائق. غسل الخلايا مع 0.5 ملليلتر من الماء العقيم عن طريق الدوامة لمدة خمس ثوان. خلايا الخميرة Pallette في 9، 000 G لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة تجاهل supernatant.
إعادة تعليق خلايا الخميرة في 0.5 ملليلتر من العازلة الترجمة العقيمة. ضع التعليق في أنبوب 15 ملليلتر. إضافة cycloheximide إلى تعليق الخلية تصل إلى التركيز النهائي من 0.2 ملليغرام لكل حضانة ملليلتر لمدة خمس دقائق الحافة التي اتخذت في 200 دورة في الدقيقة و 30 درجة لمنع الترجمة الخلوية.
إضافة من 25 إلى 30 إضافة من 25 إلى 30 ميكروكوري من S35 ميثيونين من S35 ميثيونين لتعليق الخلية واحتضان لمدة 30 دقيقة حافة اتخذت في 200 دورة في الدقيقة و 30 درجة. إضافة methionine الباردة unlabeled وborymycin لوقف حضانة وضع العلامات لمدة 10 دقائق حافة اتخذت في 200 دورة في الدقيقة و 30 درجة. جمع خلايا الخميرة عن طريق الطرد المركزي في 9، 000 G لمدة 30 ثانية.
غسل الخلايا مع 0.5 ملليلتر من الماء العقيم عن طريق الدوامة لمدة خمس ثوان. خلايا الخميرة Pallette في 9، 000 G لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. تجاهل الناتنات الفائق.
إضافة 75 ميكرولتر من العازلة تحلل إلى لوحة دوامة لمدة خمس إلى 10 ثانية. إضافة 500 ميكرولتر من 0.5 الأضراس تريس العازلة من 0.5 الأضراس تريس العازلة مع pH 6.8. مع رقم الحموضة 6.8.
دوامة لفترة وجيزة. إضافة 600 ميكرولتر من الميثانول إلى العينة. دوامة لمدة خمس ثوان.
إضافة 150 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى العينة. دوامة لمدة خمس ثوان. الطرد المركزي العينات لمدة دقيقتين في 12، 000 G.Carefully تجاهل opaface مع أخذ العينات.
إضافة 600 ميكرولتر من الميثانول إلى العينة. مزيج بعناية عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات. عينات الطرد المركزي لمدة دقيقتين في 12،000 G.Discard supernatant.
يجفف الهواء البالتات لمدة دقيقتين عند 80 درجة. حل البروتينات عجلت في 60 ميكرولتر من Laemmli عينة العازلة. سخني العينات لمدة 10 دقائق عند 14 درجة.
السبب في هلام البولي أكريلاميد 17.5٪. تحميل 15 ميكرولتر من كل عينة في جيوب. تشغيل هلام في غرفة باردة حتى الصبغة الزرقاء تصل إلى ما يقرب من 65٪ من الليمفاوية هلام.
وصمة عار الجل مع كوماسي الأزرق الرائعة وجعل المسح الضوئي أو الصورة التي هي مطلوبة كتحكم التحميل. جفف الجل في مجفف الجل. يبقيه في كاسيت مع شاشة تخزين الفوسفور لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام.
مسح الشاشة على صور الفوسفور. بعد البروتوكول المذكور أعلاه ، خصصنا منتجات ترجمة الميتوكوندريا من سلالات Saccharomyces cerevisiae. نوع البرية وحذف البديل متحولة من الجين Aim23 ترميز الميتوكوندريا عامل بدء الترجمة ثلاثة.
تم بالفعل تسمية منتجات الترجمة الميتوكوندريا وفصلها بنشاط في هلام البولي أكريلاميد. تم جمع العينات كل دقيقتين ونصف قبل التشبع لبناء الدورة الزمنية. كان الجل ملطخا ومجففا ويتم فحصه بعد المعرض الذي أقيم لمدة خمسة أيام.
في حالة تجربة ناجحة ، تظهر الصورة ثمانية نطاقات مخصصة وفقا للنمط القياسي. ومع ذلك ، يمكن أن تكون كثافة النطاقات الفردية متغيرة للغاية اعتمادا على السلالة والظروف التجريبية. يتوافق كل نطاق مع منتج ترجمة واحد.
وتشير البيانات إلى أن سلالة متحولة قادرة على تخليق البروتين الميتوكوندريا لأن جميع المنتجات التي تظهر في نوع البرية مرئية في هذا متحولة. ومع ذلك ، فإن كثافة العصابات تختلف عن النوع البري ، مما يعني أن هذا الحذف من Aim23 يؤثر على التعبير الجيني الميتوكوندريا. Kumasi تختمر في وصمة عار زرقاء وبمثابة عنصر تحكم التحميل.
ويمكن قياس نتائجها في البيانات لتحديد الاختلافات بين السلالات أو الظروف التجريبية باستخدام صورة G أو صورة كوان البرمجيات. بالنسبة لهذه، يتم حساب نسبة الإشارة المقابلة لكل منتج إلى إجمالي الإشارة. يتم حساب متوسط القيم والانحرافات المعيارية في ثلاث تجارب مستقلة على الأقل.
تتم دراسة حركية البروتين المركب الذي تم تسليمها في تجربة العام الماضي. يتم جمع العينات في النقاط الزمنية المشار إليها بعد توقف رد فعل وضع العلامات عن طريق الميثيونين البارد والبوريميسين. عنصر التحكم هذا ضروري لتقدير استقرار المنتج.
تلطيخ المناعة مع مكافحة بورين الأجسام المضادة واحد هو التحكم في التحميل. وصفنا هذه الطريقة، والتي غالبا ما تستخدم لدراسة التمثيل الحيوي البروتين في الميتوكوندريا الخميرة. هذا البروتوكول بسيط نسبيا وسريع الأداء.
في الوقت نفسه، فإنه يسمح للحصول على معلومات قيمة حول معدل الترجمة من أربعة MRNAs الميتوكوندريا الخميرة، وهو أمر مفيد للغاية. ومع ذلك، لديها العديد من القيود التي تتطلب تجارب إضافية وتقع في هذه المستويات بين الولايات من البروتينات والرنانات. يمكن أن توفر المعلومات حول هذه الوظائف في نظام الترجمة الميتوكوندريا، ولكن ينبغي استخدام تقنيات أكثر تقدما لاكتشاف الآلية.
