تم تصميم هذا البروتوكول لتحديد توطين submitochondrial من بروتينات الميتوكوندريا الخميرة، والتي تعتبر خطوة أساسية خلال توضيح وظيفة البروتين الميتوكوندريا. البروتوكول مناسب لسلالات الخميرة لدينا الحفاظ عليها في ظروف النمو المختلفة. تمثل أداة قوية للبحث ودراسة الميتوكوندريا.
لتبدأ, سلسلة خلايا من مخزون الجلسرين المخزنة في 80 C, على لوحة أجار YPD لعزل مستعمرات واحدة من سلالة من الاهتمام. واحتضان لوحة في 30 C لمدة 2 إلى 3 أيام. إعداد ثقافة بداية عن طريق تلقيح 2 إلى 3 مستعمرات فردية من لوحة أجار YPD في قارورة Erlenmeyer 100 مل تحتوي على 10 إلى 30 مل من المتوسط YPGal.
احتضان القارورة في 30 C لمدة 24 ساعة مع اهتزاز قوي في 180 إلى 200 دورة في الدقيقة. تمييع ثقافة المبتدئين إلى 1 لتر من متوسط YPGal الطازج إلى كثافة بصرية أقل من 0.1 في 600 نانومتر. زراعة الخلايا في 30 C مع اهتزاز قوي في 180 إلى 200 دورة في الدقيقة لمدة 12 ساعة تقريبا، حتى تصل الكثافة البصرية 1 إلى 1.5.
تنفيذ عزل الميتوكوندريا تنقية عالية كما هو موضح في النص. وتحديد تركيز البروتين من إعداد الميتوكوندريا تنقية عالية، وذلك باستخدام المقايسة برادفورد، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ضبط تركيز البروتين إلى 10 ملغ / مل مع الجليد الباردة SEM العازلة.
نقل 40 لتر من الميتوكوندريا عالية النقاء إلى أربعة 1.5 مل قبل المبردة والمسمي أنابيب الطرد المركزي الدقيق. إضافة 360 لتر من المخزن المؤقت SEM في الأنابيب الأولى والثانية. و 360 لتر من العازلة EM في الأنابيب الثالثة والرابعة.
باستخدام مخطط pipetting، وفقا للنص، إضافة 4 لتر من البروتين الطازج K في الأنبوب الثاني والرابع. بعد خلط جميع الأنابيب بلطف، احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة مع خلط عرضية. لوقف نشاط البروتين K إضافة 4 لتر من 200 م م PMSF لجميع الأنابيب الأربعة.
الطرد المركزي الأنابيب في 20, 000 س غ لمدة 30 دقيقة في 4 C.وجمع supernatant, دون إزعاج بيليه, في أنبوب جديد 1.5 مل المبردة مسبقا المسمى الطرد المركزي. بعد ذلك ، resuspend بيليه في 400 لتر من الجليد الباردة SEM العازلة. لتثبيط الآثار المحتملة للبروتيناز K، يعجل الناطقات التي تم جمعها وإعادة إنفاق بيليه مع حمض ثلاثي الكلور إلى تركيز نهائي من 10٪ احتضان الأنابيب على الجليد لمدة 10 دقائق.
الطرد المركزي حمض ثلاثي الكلور الأسيتيك تعامل عينات لمدة 10 دقائق في 12، 000 x ز في 4 C.And بعد إزالة supernatant، resuspend بيليه في 200 لتر من العازلة عينة. إذا تحول اللون الأزرق بروموفينول الأصفر، إضافة 1 إلى 5 لتر من قاعدة تريس 1 M، حتى يتحول الأزرق. إضافة 4 لتر من 200 م م PMSF لجميع الأنابيب.
تخزين العينات في 80 C حتى مزيد من التحليل من قبل SDS-PAGE ولطخة الغربية. نقل 200 لتر من الميتوكوندريا تنقية عالية في أنبوب 1.5 مل قبل المبردة الطرد الدقيق. تمييع الميتوكوندريا مرة واحدة مع عازلة SEM الباردة الجليد.
باستخدام sonicator متوافقة مع وحدات التخزين الصغيرة، سونيكاتي الميتوكوندريا 3 مرات لمدة 30 ثانية على الجليد. طرد مركزي العينة لمدة 30 دقيقة في 100، 000 x ز في 4 C.وجمع supernatant في أنبوب جديد 1.5 مل قبل المبردة الطرد المركزي. بعد وضع علامة على الأنبوب باسم S "لجزء البروتين القابل للذوبان ، حافظ على الأنبوب على الجليد.
Resuspend بيليه من الخطوة السابقة في 400 لتر من الجليد الباردة SEM العازلة. نقل 100 لتر من بيليه resuspended في أنبوب جديد 1.5 مل قبل المبردة الطرد المركزي. تسمية أنبوب كما SMP "للجسيمات submitochondrial كسر، والحفاظ على أنبوب على الجليد.
تمييع المتبقية 300 لتر من بيليه resuspended مرة واحدة مع الطازجة أعدت 200 mM كربونات الصوديوم. واحتضان العينة المخففة على الجليد لمدة 30 دقيقة. ثم، طرد مركزي العينة لمدة 30 دقيقة في 100، 000 × ز في 4 C.Collect الناتة في أنبوب جديد 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الصغيرة المبردة مسبقا.
تسمية العينة باسم CS "لكسر الكربونات الفائقة، والحفاظ على أنبوب على الجليد. Resuspend بيليه من الخطوة السابقة في 400 لتر من الجليد الباردة SEM العازلة. واسم العينة باسم CP "للكسر المرسب الكربونات.
عجل جميع العينات مع حمض ثلاثي الكلور إلى تركيز النهائي من 10٪واحتضان الأنابيب على الجليد لمدة 10 دقائق. ثم، الطرد المركزي العينات لمدة 10 دقائق في 12، 000 x ز في 4 C.After إزالة supernatant، resuspend كل بيليه في المخزن المؤقت العينة. إذا أصبح المخزن المؤقت عينة صفراء، إضافة 1 إلى 5 لتر من قاعدة 1 M تريس حتى يتحول إلى اللون الأزرق.
إضافة 1 لتر من 200 م م PMSF إلى جميع الأنابيب وتخزينها في 80 C حتى مزيد من التحليل من قبل SDS-PAGE ولطخة الغربية. تم تنقية كسر الميتوكوندريا الخام على الطرد المركزي المتدرجة كثافة السكروز، ولوحظ انخفاض في الملوثات الخلوية الأخرى. تم رصد الميتوكوندريا لتحويل mitoplast عن طريق اختفاء بروتين الفضاء بين الميمبران cytochrome b2 في بيليه.
مع المظهر المصاحب في الفائقة. وقد لوحظ تدهور البروتين K بوساطة من البروتين بين الميمبرين Sco1 بسبب اضطراب الغشاء الخارجي عن طريق الصدمة التناضحية. تم تأكيد سلامة غشاء الميتوكوندريا الخارجي من خلال حماية السيتوكروم B2 و Sco1 ضد تدهور البروتين K في جزء بيليه.
وبالمثل، أكدت حماية البروتين القابل للذوبان مصفوفة KGD سلامة الغشاء الميتوكوندريا الداخلية. Prx1 الشخصية لطخة الغربية اقترح توطين الميتوكوندريا المزدوجة في الفضاء intermembrane ومصفوفة. تعرضت الميتوكوندريا ل sonication واستخراج الكربونات للتحقيق في طوبولوجيا بروتينات الأغشية.
بقي البروتين الغشاء المتكاملة صب في الكسور بيليه. تم الكشف عن KGD في كسر فائقة. وكان الكشف عن بروتين KGD في بيليه بسبب الاختلافات معلمة سونيكيشن التي تؤثر على تشكيل الشركات الصغيرة والمتوسطة.
بعد معالجة كربونات الصوديوم ، تم تليين KGD وكسر SMP ووجد في الكسر الفائق. Prx1 الشخصية لطخة الغربية اقترح وجود ارتباط مع محيط الغشاء. لنجاح بروتوكول الكسر التقدي، من المهم وقف نشاط البروتين K بعد تورم هيبوتونيك عن طريق إضافة PMSF إلى العينات.
توفر المواقع معلومات حول توطين البروتين التقديمي. يمكن استخدام هذا البروتوكول أيضا للتحقق من سلامة الاستعدادات الميتوكوندريا ، وهو أمر أساسي أثناء الدراسات البروتيوميكية للأقسام الفرعية الميتوكوندريا.
