هذا الفحص في المختبر التصوير يجعل من الممكن تحديد تأثير علاجات الخلايا المختلفة أو الأنماط الجينية المختلفة على البلعومية المجهرية. باستخدام نوعين من الخلايا ذات الصلة بالأمراض العصبية التنكسية ، نستخدم خلايا الورم الأرومي العصبي الميت للشحنة البلعومية ، والتي يتم إعدادها بطريقة يمكن توسيعها بسهولة وبتكلفة زهيدة من خلال شاشات تصوير كبيرة عالية المحتوى. في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة 2 ، ينفر SH-SY5Ys عن طريق قرصنة الوسط.
إضافة 4 مل من العازلة فصافر الخلية، وإزالة العازلة على الفور بحيث تبقى أقل من 1 مل كطبقة رقيقة طلاء الخلايا. حضانة لمدة 2 إلى 3 دقائق في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ثم في 10 مل من HBSS إلى قارورة T-75.
وماصة SH-SY5Ys في أنبوب الطرد المركزي مخروطي 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 400xG لمدة 5 دقائق. يستنشق supernatant، وإعادة تعليق الخلايا في 2 مل من فينول الأحمر خالية HEPES وسائل الإعلام المخزنة مؤقتا، مع التأكد من تفريق كتل قبل التثبيت.
إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 2 مل من 4٪ فورمالديهايد السلطة إلى الأنبوب واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع التحريض لطيف في بعض الأحيان. إضافة 10 مل من HBSS إلى الأنبوب. ثم، الطرد المركزي في 1200xG لمدة 7 دقائق.
يستنشق supernatant، وإعادة تعليق بيليه الخلية في 2 مل من فينول الأحمر خالية HEPES وسائل الإعلام المخزنة مؤقتا. عد وإزالة 1 مليون خلايا HS-SY5Y في أنبوب 2 مل منخفضة البروتين ملزمة. رفع الحجم الإجمالي إلى 300 إلى 500 ميكرولتر مع فينول الأحمر خالية من HEPES وسائل الإعلام المخزنة مؤقتا.
ثم لفترة وجيزة الحارة الأنبوب في حمام الماء 37 درجة مئوية. إعادة تشكيل الحساسة الحموضة صبغة الفلورسنت الأحمر إس تي بي إستر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم أضف 12.5 ميكروغرام من الصبغة لكل مليون خلية SH-SY5Y.
مزيج بلطف عن طريق النقر على الأنبوب. واحتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، محمية من الضوء. أضف مل واحد من HBSS والطرد المركزي عند 1200xG لمدة 7 دقائق و 4 درجات مئوية.
تجاهل الناتنات الفائق. ويغسل مع 2 مل من HBSS. إعادة تعليق بيليه الخلية في وسائط الفينول الخالية من الفينول إلى تركيز من 0.2 إلى 1.2 مليون خلية لكل مل ، بحيث تحتوي 50 ميكرولتر على 10 إلى 60000 خلية.
في خزانة السلامة البيولوجية، وإعداد حل للخلية الفلورية الحمراء العميقة permeant succinimidyl إستر التفاعلية صبغة في وسائل الإعلام الضامة. إضافة Hoechst 33342، وتدفئة حل العمل إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. يستنشق المتوسط الضامة iPSC بلطف، عن طريق الأنابيب خلية فائقة مع ماصة متعددة القنوات في خزان معقم.
إضافة 70 ميكرولتر لكل بئر من محلول الصبغة إلى الضامة iPSC باستخدام ماصة متعددة القنوات. حضانة لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. إصلاح العلاجات التجريبية في وسائط الفينول الخالية من الكوافر الحمراء.
بعد الحضانة، يستنشق المتوسط الضامة iPSC بلطف شديد مع ماصة متعددة القنوات، وإضافة 100 ميكرولتر من HBSS لكل بئر. إزالة HBSS على الفور عن طريق الأنابيب لطيف. ثم أضف 100 ميكرولتر من وسائط الفينول الخالية من الفنول ، بالإضافة إلى العلاجات التجريبية في آبار منفصلة.
احتضان لمدة 10 دقائق إلى 1 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 50 ميكرولتر من SH-SY5Ys المسمى لكل بئر من جوانب كل بئر على حافة السائل. ثم تحتضن في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 3 إلى 5 ساعات.
بعد حضانة البلعوس ، يستنشق الخلايا بلطف عن طريق الأنابيب مع ماصة متعددة القنوات والتخلص منها. يغسل مرة واحدة مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. ثم إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 2٪ الفورمالديهايد السلطة واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
آبار اسبيرات وإضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. إما المضي قدما مباشرة إلى التصوير مع المجهر عالية المحتوى، أو تغطية مع مانع للتسرب لوحة واحباط، وتخزين لوحة في 4 درجات مئوية، حتى المطلوبة. قم بتشغيل مجهر التصوير عالي المحتوى، وافتح برنامج التقاط الصور.
تحميل لوحة المقايسة في المجهر عن طريق النقر على LOAD"أيقونة في الجزء العلوي من الشاشة. حدد علامة التبويب SETUP" . في القوائم المنسدلة في أعلى المربع الأيمن، حدد نوع اللوحة المناسب.
الخيار التركيز البؤري التلقائي:اثنين الذروة"الهدف:40x المياه, NA 1.1 "كونفوجال"وضع, وبينينغ من 1. قم بمسح هدف 40x Water قبل الاستخدام عبر قائمة الإعدادات. في مربع تحديد القناة، استخدم رمز الجمع لإضافة قنوات DAPI وAlexa 647 وAlexa 568.
تعيين هذه لقياس في مستوى واحد من ميكرومتر واحد. تحسين إعدادات الوقت والطاقة لكفاءة تلطيخ لوحة المقايسة. تأكد من عدم قياس القنوات في وقت واحد، من خلال النقر على تسلسل القناة لفصل القنوات.
ضمن التنقل وتحديد التخطيط، حدد آبار القياس، وحدد 9 إلى 12 حقلا لكل بئر. أثناء الإعداد، انقر على حقل تمثيلي على خريطة اللوحة. وتحقق من كل قناة قياس بدورها للتأكد من وجود تلطيخ ، وأن الصور تركز عن طريق ضبط إزاحة القناة.
لتحميل البيانات إلى خادم للتحليل عن بعد، انقر على الوظائف عبر الإنترنت"مربع واسم الشاشة ذات الصلة. حفظ بروتوكول الفحص عن طريق النقر على حفظ"زر، وانقر على تشغيل التجربة"علامة التبويب في الجزء العلوي. اسم لوحة التجربة، ثم انقر على بدء "وقت الخلية الحية يعيش فحص البلعوم أظهرت أنه مع 10، 000 SH-SY5Ys لكل بئر، زاد عدد جزيئات الفسيقاتوز لكل خلية خطيا مع مرور الوقت، وتثبيطها بنسبة 50٪ تقريبا من قبل Cytochalasin D.With كميات أعلى من SH-SY5Ys لكل بئر، أظهر البلعوم خطيا ضعيفا، على الأرجح بسبب ضعف تجزئة iPSC، الضامة، وSH-SY5Ys في مجال أكثر ازدحاما من العرض.
تم الحصول على النتائج التالية من خلال إجراء تصوير عالي المحتوى للخلايا الثابتة ، بما في ذلك هذه الصورة التمثيلية للداء البلعوي. أدت زيادة كمية SH-SY5Ys إلى ارتفاع عدد الجسيمات الفسجية لكل خلية. تم التحقق من صحة فحص البلعوس باستخدام عدة مثبطات من البلعوس.
سيتوشالاسين D وجاسبلاكينوليد منعت بشكل كبير البلعوس بنسبة 91 و 90 في المئة على التوالي. وBafilomycin A1 خفضت بشكل كبير البلعوم بنسبة 31٪ عندما قبل حضانة لمدة 1 ساعة قبل البلعوم. إضافة الملحق المؤتلف 5 انخفاض كبير في البلعوس بنسبة 30٪ عند إضافتها إلى الآبار مباشرة قبل إضافة SH-SY5Y.
ثابت SH-SY5Ys نحن أكد لفضح فوسفاتيديلسيرين باستخدام مسبار الفلورسنت الملحقين 5. في حين أن SH-SY5Ys الحية كانت سلبية لتلطيخ Annexin 5. تم اختبار عدة أطوال من مدة البلعوس ، من ساعة إلى 5 ساعات ، باستخدام إضافة متداخلة من البضائع البلعوسية.
يمكن تقصير الطول الإجمالي لهذا البروتوكول عن طريق إعداد الشحنة البلعوية وتلطيخ الضامة iPSC بالتوازي. إذا كنت ترغب في القيام بذلك، والعمل على توقيت مقدما، واستخدام الحضانات الخاصة بك لإعداد حلول للخطوات المستقبلية.
