Este ensaio de imagem in vitro permite quantificar o efeito de diferentes tratamentos celulares ou genótipos diferentes sobre a fagocitose microglial. Usando dois tipos de células relevantes para doenças neurodegenerativas, usamos células de neuroblastoma mortas para a carga fagocítica, que são preparadas de uma forma que pode ser facilmente e baratamente dimensionada por grandes telas de imagem de alto conteúdo. Em um gabinete de segurança biológica classe 2, dissociar SH-SY5Ys aspirando o meio.
Adicione 4 ml de tampão de dissociação celular e remova o buffer imediatamente para que menos de 1 ml permaneça como uma película fina que reveste as células. Incubar por 2 a 3 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, a 10 ml de HBSS para o frasco T-75.
E pipeta o SH-SY5Ys em um tubo de centrífuga cônica de 15 ml. Centrifugar a 400xG por 5 minutos. Aspire o supernascimento e suspenda as células em 2 ml de mídia tamponada hepes sem fenol, certificando-se de quebrar aglomerados antes da fixação.
Fixar as células adicionando 2 ml de formaldeído de 4% de potência ao tubo e incubando por 10 minutos em temperatura ambiente com agitação suave ocasional. Adicione 10 ml de HBSS ao tubo. Em seguida, centrífuga a 1200xG por 7 minutos.
Aspire o supernasciente, e suspenda a pelota celular em 2 ml de mídia tamponada hepes sem fenol. Conte e remova 1 milhão de células HS-SY5Y em um tubo de baixa ligação de proteínas de 2 ml. Leve o volume total para 300 a 500 microliters com mídia tamponada HEPES sem fenol.
Em seguida, aqueça brevemente o tubo em um banho de água de 37 graus Celsius. Reconstitua o éster stp de corante vermelho sensível ao pH de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, adicione 12,5 microgramas de corante por milhão de células SH-SY5Y.
Misture suavemente apertando o tubo. E incubar o tubo em temperatura ambiente por 30 minutos, protegido da luz. Adicione 1 ml de HBSS e centrífuga a 1200xG por 7 minutos e 4 graus Celsius.
Descarte o supernatante. E lave com 2 ml de HBSS. Suspenda a pelota celular na mídia de macrófago livre de fenol para uma concentração de 0,2 a 1,2 milhões de células por ml, de modo que 50 microlitres contêm de 10.000 a 60.000 células.
Em um gabinete de segurança biológica, prepare uma solução de células fluorescentes vermelhas profundas com corante éster-reativo em meios de macrofago. Adicione Hoechst 33342, e aqueça a solução de trabalho a 37 graus Celsius em um banho de água. Aspire o meio macrófago iPSC suavemente, tubondo a célula supernante com uma pipeta multicanal em um reservatório estéril.
Adicione 70 microliters por poço da solução de corante aos macrófagos iPSC usando uma pipeta multicanal. Incubar por 1 hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Reparar tratamentos experimentais em mídia de macrófago sem fenol.
Após a incubação, aspire o meio macrófago iPSC muito suavemente com uma pipeta multicanal, e adicione 100 microliters de HBSS por poço. Remova imediatamente o HBSS por tubulação suave. Em seguida, adicione 100 microliters de mídia de macrófago sem fenol, além de tratamentos experimentais em poços separados.
Incubar por 10 minutos a 1 hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Use uma pipeta multicanal para adicionar 50 microliters dos SH-SY5Ys rotulados por poço dos lados de cada poço na borda do líquido. Em seguida, incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 3 a 5 horas.
Após a incubação da fagocitose, aspira suavemente os supernantes celulares por pipetar com uma pipeta multicanal e descartar. Lave uma vez com 100 microliters de PBS. Em seguida, fixar as células adicionando 100 microliters de 2% de energia formaldeído e incubando por 15 minutos à temperatura ambiente.
Aspirar poços e adicionar 100 microliters de PBS. Ou proceda diretamente à imagem com o microscópio de alto teor, ou cubra com selador de placa e papel alumínio, e armazene a placa a 4 graus Celsius, até que seja necessário. Ligue o microscópio de imagem de alto conteúdo e abra o software de captura de imagens.
Carregue a placa de ensaio no microscópio clicando no ícone LOAD na parte superior da tela. Selecione a guia CONFIGURAÇÃO". Nos menus suspensos na caixa superior esquerda, selecione o tipo de placa apropriada.
A opção de foco automático:dois pico "O objetivo:40x Água, na forma DE 1.1"Confocal" e Binning de 1. Lave o objetivo de 40x Água antes de usar através do menu de configurações. Na caixa de seleção do canal, use o ícone plus para adicionar os canais DAPI, Alexa 647 e Alexa 568.
Defina isso para medir em um único plano de um micrômetro. Otimize o tempo e as configurações de potência para a eficiência de coloração da placa de ensaio. Certifique-se de que os canais não são medidos simultaneamente, clicando na sequência do canal para separar os canais.
Em navegação e definir layout, selecione os poços de medição e selecione de 9 a 12 campos por poço. Durante a configuração, clique em um campo representativo no mapa da placa. E verifique cada canal de medição, por sua vez, para garantir que a mancha esteja presente, e que as imagens estejam focadas ajustando o deslocamento do canal.
Para carregar os dados em um servidor para análise remota, clique na caixa de trabalhos online e no nome de tela relevante. Salve o protocolo de ensaio clicando no botão salvar"e clique na guia executar experimento"na parte superior. Nomeie a placa de experimento, em seguida, clique em iniciar "Um tempo de célula ao vivo vive phagocytosis ensaio mostrou que com 10, 000 SH-SY5Ys por poço, o número de partículas de fagocitose por célula aumentou linearmente com o tempo e foi inibido em aproximadamente 50% por Cytochalasin D.Com maiores quantidades de SH-SY5Ys por poço, a fagocitose apresentou baixa linearidade, provavelmente devido à má segmentação do iPSC, macrófagos, e SH-SY5Ys em um campo de visão mais lotado.
Os seguintes resultados foram obtidos por meio da realização de uma imagem de alto teor de célula fixa, incluindo esta imagem representativa da fagocitose. O aumento da quantidade de SH-SY5Ys resultou em um maior número de partículas fagocitas por célula. O ensaio de fagocitose foi validado utilizando vários inibidores da fagocitose.
Cytochalasin D e Jasplakinolide inibiram significativamente a fagocitose em 91 e 90%, respectivamente. E a Bafilomicina A1 reduziu significativamente a fagocitose em 31%, quando pré-incubada por 1 hora antes da fagocitose. A adição de anexo recombinante 5 reduziu significativamente a fagocitose em 30% quando adicionada aos poços imediatamente antes da adição sh-SY5Y.
Sh-SY5Ys fixos estamos confirmados para expor Phosphatidylserine usando uma sonda fluorescente Annexin 5. Considerando que os SH-SY5Ys vivos foram negativos para a coloração de Anexo 5. Vários comprimentos de duração da fagocitose, de 1 a 5 horas, foram testados utilizando-se adição escalonada de carga fagocítica.
O comprimento total deste protocall pode ser encurtado preparando a carga fagítica e manchando os macrófagos iPSC em paralelo. Se você quiser fazer isso, trabalhe os tempos com antecedência e use suas incubações para preparar soluções para os próximos passos.
