يعد عزل الخلية البطانية والخلالية للصمام الأولي البشري أمرا بالغ الأهمية لفهم الآلية الأساسية للتسبب في مرض الصمام الأبهري الكلسي. عندما يتم استئصال الصمام من الأنسجة الأصلية ، تنخفض صلاحية الخلية. لذلك حددنا طريقة تطيل صلاحية الخلية.
بعد استلام عينات أنسجة الصمام المستخرجة ، استخرج جذر الأبهر واغمر الأنسجة في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر يحتوي على محلول شطف معقم. بعد حضانة لمدة 10 دقائق في دلو ثلج على هزاز ، قم برش الأنابيب بنسبة 70٪ من الإيثانول. في غطاء زراعة الأنسجة المعقمة ، انقل الأنسجة إلى طبق بتري واستأصل وريقات صمامين.
ضع نشرة واحدة في قنينة مبردة وقم بتجميد الأنسجة في النيتروجين السائل لتخزين 80 درجة مئوية تحت الصفر. لإصلاح الأنسجة لتلطيخ محتوى الكالسيوم ، قم بقص النشرة الثانية إلى النصف من العقيدات إلى المفصلة وضع قطعتي الأنسجة في شريط مغمور في 4٪ بارافورمالدهيد. ثم ضع الإعداد بالكامل على الروك في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن ساعتين ولكن ليس أكثر من أربع ساعات.
لعزل الخلايا الخلالية للصمام ، انقل النشرة إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلتر يحتوي على PBS بارد ، وضع الأنبوب على هزاز لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. بعد الخلط ، انقل الأنسجة إلى طبق 60 ملم يحتوي على خمسة إلى سبعة ملليلتر من محلول كولاجيناز البارد. استخدم الملقط لغمس جانبي الوريقة ثلاث إلى أربع مرات في المحلول قبل احتضان الأنسجة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة خمس إلى 10 دقائق عند 37 درجة مئوية مع هزاز لطيف للأنسجة ثلاث إلى أربع مرات كل دقيقتين.
في نهاية الحضانة ، انقل مليلتر من المحلول من الطبق إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 ملليلتر. وضع ملقط في عقيدة النشرة ، استخدم مسحة قطنية معقمة لتمرير الأنسجة من الملقط إلى المفصلة أثناء تدوير المسحة على طول الوريقة. بعد التمرير ، اشطف المسحة في أنبوب محلول كولاجيناز ومسح الجانب الآخر من الأنسجة كما هو موضح للتو.
بعد الشطف ، كرر المسحة على جانبي الأنسجة واستخدم ماصة ملليلتر واحد ومحلول كولاجيناز لشطف أي خلايا إزاحة من جانبي سطح النشرة إلى الطبق. بعد الشطف، انقل كل المحلول من الطبق إلى الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا من المسحة وضع نسيج الصمام المتبقي في أنبوب مخروطي جديد سعة 15 ملليلتر يحتوي على سبعة ملليلتر من محلول كولاجيناز معقم. بيليه الخلايا البطانية للصمام المعزول عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه الخلية في ثلاثة ملليلتر من وسط نمو الخلايا البطانية الوعائية.
بعد الطرد المركزي الثاني ، أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من وسط النمو الطازج للعد وزرع الخلايا بمعدل 5 × 10 إلى الخلايا الخامسة لكل سنتيمتر مربع في ألواح ستة آبار مغلفة بالكولاجين ، وتحديث الوسط كل ثلاثة إلى أربعة أيام. عندما تغطي بقع الخلايا البطانية للصمام أكثر من 80٪ من الصفيحة ، قم بتقسيم الخلايا بمعدل 1.3 × 10 إلى الخلايا الرابعة لكل سنتيمتر مربع ، اعتمادا على معدل نموها. بمجرد توسيع الخلايا ، تأكد من النمط الظاهري للخلية البطانية للصمام عن طريق تلطيخ الفلورسنت المناعي لعلامات الخلايا البطانية للصمام ذات الأهمية.
لعزل الخلايا الخلالية للصمام، ضع الأنبوب الذي يحتوي على المسحة لإدخال أنسجة الوريقات في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 12 إلى 18 ساعة مع فتح الغطاء قليلا. في نهاية الحضانة ، استخدم ماصة مصلية لفصل الأنسجة بلطف لضمان إطلاق الخلايا الخلالية للصمام وتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة 70 ميكرون في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر. أضف سبعة ملليلتر من وسط الخلية الخلالية للصمام إلى الأنبوب واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من وسط نمو الخلايا الخلالي للصمام الطازج للعد وزرع الخلايا عند 1.3 × 10 من الخلايا الرابعة لكل سنتيمتر مربع في طبق معالج بزراعة الأنسجة بقطر 60 ملم. بعد يوم إلى يومين ، اغسل الثقافات مرتين باستخدام PBS وأضف وسيطا جديدا إلى الخلايا. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 90٪ ، اغسل المزروعات مرتين باستخدام DPBS وعالج الخلايا بملليلتر إلى ثلاثة ملليلتر من كاشف التفكك قبل التسخين لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق عند 37 درجة مئوية.
عندما تنفصل الخلايا ، انقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي للطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات برفق في ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من وسط نمو الخلايا الخلالية للصمام قبل التسخين للعد. ثم بذر الخلايا بنسبة واحد إلى اثنين من كثافة الثقافة الأصلية وتقييم النمط الظاهري لنمو الخلايا الخلالية للصمام عن طريق تلطيخ الفلورسنت المناعي كما هو موضح. تظهر عينات أنسجة مرض الصمام الأبهري الكلسي مورفولوجيا متغيرة مع عقيدات ثقيلة من التكلس مقارنة بعينات الأنسجة غير المتكلسة الضابطة.
عندما يتم تقييم التكلس بواسطة تلطيخ Von Kossa ، لوحظ هطول الأمطار البني الداكن أو الأسود في أنسجة المنشورات المريضة. يعمل محلول التخزين البارد على استقرار خلايا أنسجة الصمام المستأصلة بشكل كبير مع إمكانية بقاء بنسبة 40٪ تقريبا لكلا النوعين من الخلايا المستعادة حتى 61 ساعة بعد استخراج الصمام. يكشف التحليل المورفولوجي للخلايا البطانية للصمام عن خلايا مثبطة للنمو تشبه الحصى معبأة بينما تظهر الخلايا الخلالية للصمام مورفولوجيا على شكل مغزل مماثلة لتلك التي لوحظت في الخلايا الليفية العضلية.
يؤكد التلوين المناعي أن غالبية الخلايا البطانية للصمام الموسع والخلايا الخلالية للصمام تعبر عن العلامات المتوقعة الخاصة بالأنسجة. تذكر أن المسح اللطيف ولكن الثابت للنشرة أمر بالغ الأهمية لإطلاق طبقة الخلايا البطانية ، وأن الحضانة الليلية مع كولاجيناز مطلوبة لإطلاق مجموعة الخلايا الخلالية من داخل الأنسجة الكثيفة. بمجرد إنشاء خطوط الخلايا ، يمكن استخدامها للدراسة الميكانيكية فيما يتعلق بإمراض مرض الصمام الأبهري المحدد ، بما في ذلك بداية المرض وتقدمه وعلاجه.
