استخدام خلايا صمام الماوس معزولة أمر ضروري للتحقيق في مسار الإشارات المؤدية إلى تكلس صمام في استخدام الخلايا المعدلة وراثيا من الفئران المعدلة وراثيا. الهضم من خطوتين هو طريقة سريعة وفعالة. الجزء الأكثر تحديا من هذا البروتوكول هو عزل الصمام الأبهري من الفئران ثمانية أسابيع.
فمن الأفضل لممارسة على الفئران الأكبر سنا لتصور الصمام الأبهري بشكل أفضل. قبل البدء في التجربة، تنظيف وتعقيم جميع الأدوات الجراحية ومساحة العمل مع 70٪ الإيثانول وautclave الأدوات الجراحية لمدة 30 دقيقة. عندما يكون الإعداد الأولي جاهزا، ابدأ بتنظيف منطقة الصدر والبطن من فأرة القتل الرحيم التي يبلغ عمرها ثمانية أسابيع باستخدام الإيثانول.
باستخدام مقص، افتح البطن وصدر الفأرة، ثم قطع بين الأذين الأيسر والبطين الأيسر مع مقص الجراحية الصغيرة. إزالة الدم من القلب عن طريق غرس 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة وقطع القلب، والحفاظ على ثلاثة ملليمترات من الشريان الأورطي الصاعد. تحت منظار مجسم، قم بتشريح الصمام الأبهري عن طريق قطع القلب أفقيا في منتصف البطينين وقطع البطين الأيسر نحو الشريان الأبهري، ثم تشريح الصمام الأبهري بعناية.
تجمع الصمامات معا في طبق صغير 35 ملليمتر زراعة الأنسجة. اغسل الصمامات المعزولة في طبق ثقافة الخلايا 75 ملليلتر مع خمسة ملليلترات من HEPES الباردة الطازجة 10 ملليمولار تكملها المضادات الحيوية واحتضانها في خمسة ملليلترات من نوع الكولاجيناز واحد لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر. بعد الحضانة، طرد المركزي أنبوب لمدة خمس دقائق، في 150 مرة G وغسل بيليه مرة واحدة مع اثنين من ملليلتر من HEPES 10 ملليمولار مع دوامة بسرعة عالية لمدة 30 ثانية.
جمع تعليق الناتجة من الأنبوب إلى طبق ثقافة 35 ملليمتر واستخدام ملاقط رقيقة لنقل بعناية شظايا الأنسجة في أنبوب جديد. ثم احتضان بيليه في أنبوب 15 ملليلتر مع خمسة ملليلتر من نوع الكولاجيناز واحد في 37 درجة مئوية تحت التحريض المستمر لمدة 35 دقيقة. فصل الخلايا عن طريق إعادة تعليق مع ماصة ملليلتر واحد والطرد المركزي في 150 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية.
تنظيف الخلايا مرتين عن طريق إعادة تعليق بيليه فصل في اثنين من ملليلتر من DMEM كاملة والطرد المركزي في 150 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. للطلاء، resuspend بيليه في ملليلتر واحد من المتوسطة كاملة وإضافته إلى بئر واحد من ستة طبق ثقافة الخلايا جيدا في الحد الأدنى من المتوسطة. الحفاظ على لوحات دون عائق في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد ثلاثة أيام من الحضانة ، تأكد من النمو بالقرب من حطام الأنسجة من خلال مراقبة الخلايا تحت المجهر. مرة واحدة 1, 000 الخلايا مرئية, إزالة بعناية حطام الأنسجة مع ملاقط autoclaved وتغيير المتوسطة. جرب الخلايا بعد الوصول إلى التقاء 70٪ ونقلها إلى طبق زراعة الأنسجة 75 ملليلتر.
قبل البدء في الفحص، قم بتنظيف غطاء السلامة البيولوجية باستخدام الإيثانول بنسبة 70٪، ودفئ متوسط DMEM إلى 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، البذور 100،000 خلية لكل حالة في ست لوحات بئر في DMEM كاملة والثقافة في 37 درجة مئوية. بعد 24 ساعة، استبدل الوسط الفائق بالمتوسط المتكلس واحتضن الخلايا لمدة سبعة أيام عند 37 درجة مئوية، ليحل محل الوسط في اليوم الثالث.
بعد سبعة أيام، قم بقياس تركيز الكالسيوم في لوحة بئر 96 باستخدام كاشف أرسينازو الثالث وتسجيل الامتصاص عند 650 نانومتر. في التحليل التمثيلي ، تم تحديد الأنماط الظاهرية المختلفة لخلايا الصمام مع تلطيخ المناعة بعد ثلاثة إلى خمسة أيام من الثقافة. الماوس VIC أعرب vimentin وألفا SMA، علامات هامة من خلايا صمام.
بالإضافة إلى ذلك، تحققت تلطيخات المناعة CD31 من عدم وجود تلوث من الخلايا البطانية في ثقافة مركز فيينا الدولي. زراعة مركز فيينا الدولي مع الفوسفات الغنية تكلس المتوسطة تحفيز تكلس في الخلايا، وأكد كذلك مع تلطيخ إيجابية حمراء لعقد الكالسيوم. ويستند البروتوكول على مجموعة من ثلاثة إلى خمسة صمام من الفئران المختلفة.
ومن المهم استخدام رفيقة القمامة وثلاث نسخ بيولوجية مختلفة للتحقق من صحة النتائج. استخدام خلايا صمام الماوس أمر حيوي لفهم المسار الجزيئي المؤدي إلى تضيق الأبهر عن طريق عزل الخلايا من الفئران المعدلة وراثيا. وقد استخدم هذا البروتوكول سابقا للتحقيق في الآثار المترتبة على المسار إلى مستقبلات في الانحدار المعدني للصمام الأبهري المتكلس.
