نشكر مرفق جامعة ولاية أوهايو مركز السرطان الشامل تحليلية الخلوي الأساسية، وتحديدا كاترينا مور، للمساعدة التقنية مع تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية. وبالإضافة إلى ذلك فإننا ندرك الدكتور ويليام بو وجماعته للرؤى العلمية. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة HL091878 (JL) ومركز القلب في مستشفى الأطفال على الصعيد الوطني.

1. إعداد المعدات وحلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم أدوات تشريح - مقص النسيج غرامة لاستخراج قلوب الكبار و2 ملقط غرامة لتشريح المنطقة صمامي - بواسطة التعقيم في علبة أداة مغطاة. أدوات رش مع 70٪ من الإيثانول (ETOH) قبل تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد جميع الحلول فورا قبل التجربة وتعقيم الحلول من خلال تمريرها من خلال العقيمة 0.2 ميكرون التصفية. إبقاء الحلول على الجليد حتى الاستخدام. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معقم التفكك العازلة (15 مل الإجمالية / عينة). الجمع بين 1.2 مل كولاجيناز الرابع، 300 ميكرولتر 2.5٪ التربسين و 150 ميكرولتر مصل الفرخ. جعل حجم ما يصل الى 15 مل مع محلول الملح هانك المتوازن (HBSS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معقمة الفرز العازلة (12 مل المجموع). تجمع 25 ميكرولتر 0.5 M حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA) و 12 ميكرولتر الدناز الأول (خالية من ريبونوكلياز). جعل حجم ما يصل الى 12 مل مع HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مركزنا الثقافة وسائل الإعلام. ميكس غرو البطانيةوث وسائل الإعلام وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (انظر جدول المواد) وذلك بإضافة مكونات aliquoted من عدة إلى 500 مل من EBM2 سائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> GFP سلبي الثقافة وسائل الإعلام (وسائل الإعلام الخلايا غير البطانية). خلط 445 مل من متوسط ​​199 1X مع 5 مل من البنسلين / الستربتومايسين (القلم / بكتيريا) (1٪ تركيز النهائي) و 50 مل FBS (10٪ تركيز النهائي). </li></ol></li></ol> 2. تشريح المنطقة الصمامية من الفئران الكبار والأجنة E14.5 <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية وتنفيذ وفقا للمبادئ التوجيهية معهد بحوث مستشفى IACUC وعلى الصعيد الوطني للطفولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم شراء الفئران Tie2-GFP من جاكسون معامل (عدد الأسهم 003658) 14 و تمت المحافظة كما المورثات متماثلة اللواقح على خلفية FVB / N، وبالتالي ضمان أن جميع GFP خارج الربيع صريح في الخلايا البطانية Tie2 إيجابية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لFACS الفرز، وإعداد سن يقابل واحد عصيدة السلبيةلو أن لا يحتوي GFP مثل C57 / BL6 لتعيين المعلمات بوابة GFP لFACS الفرز. ملاحظة: هذا البروتوكول والنتائج تمثيلية تعتمد على استخدام ثلاثة، الفئران البالغة من العمر أربعة أشهر أو لتر واحد في اليوم الجنينية (E) 14.5. </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفئران الكبار: التضحية التالية مباشرة بواسطة CO 2 نقص الأكسجين، واستخدام مقص تشريح لفتح بلطف تجويف الصدر وكشف القلب والرئتين. تعرض مرة واحدة، وقبضة القلب مع ملقط على الشرايين الكبيرة وسحب بعيدا عن الجسم. إزالة أنسجة الرئة إذا سليمة، وقلوب مكان في HBSS البارد لشطف. إزالة البطين والأذين الانسحاب بعيدا تاركا القناة الأذينية البطينية &#39;عصابة&#39; والمناطق الأورطي سليمة. جعل شق واحد أسفل الجانب من القناة الأذينية البطينية لفتح &#39;عصابة&#39; وفضح الهياكل صمامي. إزالة عضلة القلب والشريان الأبهر المناطق القريبة من إغاظة بلطف بعيدا بالملقط. التعرف على منشورات صمام والبيضاء، والأنسجة الكثيفة على عضلة القلب الوردي. ديتا بلطفCH يقع tendinae الحبل من الصمامات الأذينية البطينية وإزالة أكبر قدر من عضلة القلب المتبقية ممكن. توخي الحذر لعدم سحب أو كشط منشورات صمام أثناء هذه العملية منذ VECs يمكن فكها. وضع المناطق صمامي قلصت في أنبوب 1.5 مل إيبندورف تحتوي على 1 مل HBSS والحفاظ على الجليد. ملاحظة: تشريح دقيق أمر بالغ الأهمية للقضاء على الخلايا البطانية غير صمامي التي يمكن أن تلوث العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجنة: النحر إناث الفئران بعد 14.0 يوما لوحظ الجماع المكونات (صباح الجماع المكونات = 0.5 أيام). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التضحية الفور، تشريح الرحم (التي تحتوي على أجنة) ويغسل في HBSS الباردة. تشريح الأجنة الفردية من الرحم وإزالة الكيس المحي الجنينية المحيطة بكل الجنين. إزالة قلوب من كل من الأجنة واتبع الخطوة 2.1. (ملاحظة: الضغط بلطف الجنين بالملقط فقط دون الزوائد العليا ينبغي أن تساعد في فضح القلب وجعل إزالة أسهل.) </li></ol></li></ol><pالطبقة = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. تفكك خلية والتحضير لFACS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نصائح باستخدام ماصة معقمة، إزالة HBSS من الأنبوب إيبندورف تحتوي على مناطق صمامي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال مع 1 مل تفارق العازلة و4 ميكرولتر الدناز I. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة صعودا وهبوطا 3 مرات ومن ثم السماح للعينة تستقر لمدة 15 ثانية. جمع طاف (التي تحتوي على الخلايا فصلها) في أنبوب مخروطي 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوقف رد فعل كولاجيناز، إضافة 125 ميكرولتر من مصل الحصان إلى أنبوب جمع. إبقاء أنبوب جمع على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات التفكك (3،2-3،5) تسع مرات لجمع تسعة أجزاء من طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير مجموعة منشقة من خلال مرشح النايلون 70 ميكرومتر في أنبوب المجموعة الجديدة لضمان تعليق خلية واحدة عن طريق إزالة أي حطام وكتل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور تعليق في 400 غ لمدة 5 دقائق لخلايا بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية خلية في 1 مل العازلة الفرز والحفاظ على الجليد حتى FACS. </li></ol> 4. FACS فرز GFP VECs إيجابي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بوابات لالأمام والجانب مبعثر لاستبعاد الحطام والتقاط الخلايا واحدة؛ استبعاد الحلل باستخدام التمييز صدرة النابضة. تسجيل عينة السيطرة السلبية وتحديد إعدادات بوابة من أجل مقارنة وبدقة تحديد السكان الخلية GFP إيجابية في العينة Tie2-GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الخلايا إيجابية GFP عبر نظام مراقبة الأصول الميدانية وصقل إعدادات البوابة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نوع العينة Tie2-GFP وجمع كل من الخلايا GFP إيجابية وGFP سلبية. إذا كان سيتم استخدام خلايا لاستخراج الحمض النووي الريبي، نوع مباشرة في مخزن الفرز. إلى خلايا الثقافة بعد نظام مراقبة الأصول الميدانية، وجمع خلايا إيجابية GFP في أنبوب معقم يحتوي على 1 مل سائل الإعلام مركزنا مع 1 مل FBS، وجمع الخلايا GFP السلبية في 1 مل من وسائل الإعلام غير البطانية مع 1 مل FBS. استخدام هذا 50٪ مزيج سائل الإعلام / 50٪ مصل لتحسين بقاء الخلية. الحفاظ على الجليد حتى التحليل FACS آخر. </li></ol> 5. مشاركة FACS s تحليلق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج الحمض النووي الريبي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فور FACS، الخلايا الإيجابية والسلبية GFP الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 8 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة بعناية طاف (عازلة فرز) وتجاهل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية الخلية (بيليه ليس لأحجام العينات الموصى بها هنا المرئي) في 200 ميكرولتر Trizol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد في -80 درجة مئوية أو تبدأ استخراج القياسية الفينول كلوروفورم لعزل إجمالي مرنا كما هو موضح سابقا لدينا مختبر 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 50-200 نانوغرام من الحمض النووي الريبي لتخليق [كدنا] باستخدام Mastermix فقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخضع [كدنا] إلى التضخيم PCR الكمي باستخدام تحقيقات IDT أوقات الذروة QPCR ضد علامات خلية الماوس البطانية (CD31، عامل فون ويلبراند (VWF))، وعلامات صمام خلية الخلالي (الأكتين العضلات السلس α (α-SMA)، Periostin (Postn))، العضلية علامات (Mhc6، Mhc7) وGAPDH. </li></oل&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة الفئران مركزنا: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد FACS الفرز وجمع خلية (الخطوة 4.3)، وخلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة بعناية قبالة طاف (فرز عازلة + وسائل الاعلام) وتجاهل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية خلية GFP إيجابية في 1 مل من وسائل الإعلام مركزنا وبيليه GFP سلبية في 1 مل سائل الإعلام غير البطانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة كل عينة في بئر واحدة من غرفة الشريحة البلاستيكية وتنمو حتى متموجة. الثقافة لحوالي 1 أسبوع لخلايا GFP السلبية لتصبح متكدسة وأكثر من 2 أسابيع للخلايا إيجابية GFP لتصبح متموجة (من عينة من 3 والفئران البالغين). تغيير وسائل الاعلام كل يومين. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلطيخ مناعي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الاعلام من الخلايا وإصلاح في بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) لمدة 30 دقيقة في RT. غسل الخلايا الثابتة ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل حل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الآبار غرفة من الشرائح وكتلة في 5٪ مصل بقري الزلال / 1X PBS لمدة 1 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضانالشرائح O / N في 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية (CD31، 1: 1،000 الأكتين أو العضلات السلس α (α-SMA)، 1: 100). غسل 3X لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الضد الثانوية (اليكسا فلور 568 الماعز لمكافحة فأر) 1: 400 في برنامج تلفزيوني، إضافة إلى الشرائح، واحتضان 1 ساعة على RT. الشرائح شطف 3X لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في جبل Vectashield التي تحتوي على دابي واحتضان 1 ساعة عند 4 درجات مئوية قبل عرض. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Tao, G., Kotick, J. D., Lincoln, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+development,+maintenance,+and+disease:+the+role+of+endothelial+cells.">Heart valve development, maintenance, and disease: the role of endothelial cells.</a> Current topics in developmental biology. 100, 203-232 (2012).</li><li>Lincoln, J., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+developmental+mechanisms+of+congenital+heart+valve+disease.+Birth+defects+research.">Molecular and developmental mechanisms of congenital heart valve disease. Birth defects research.</a> Part A, Clinical and molecular teratology. 91, 526-534 (2011).</li><li>Tao, G., Levay, A. K., Gridley, T., Lincoln, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mmp15+is+a+direct+target+of+Snai1+during+endothelial+to+mesenchymal+transformation+and+endocardial+cushion+development.">Mmp15 is a direct target of Snai1 during endothelial to mesenchymal transformation and endocardial cushion development.</a> Developmental biology. 359, 209-221 (2011).</li><li>Weinberg, E. J., Mack, P. J., Schoen, F. J., Garcia-Cardena, G., Kaazempur Mofrad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+environments+from+opposing+sides+of+human+aortic+valve+leaflets+evoke+distinct+endothelial+phenotypes+in+vitro.">Hemodynamic environments from opposing sides of human aortic valve leaflets evoke distinct endothelial phenotypes in vitro.</a> Cardiovasc Eng. 10, 5-11 (2010).</li><li>Hinton, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+remodeling+and+organization+in+developing+and+diseased+aortic+valves.">Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves.</a> Circulation research. 98, 1431-1438 (2006).</li><li>Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+and+cellular+response+feedback+in+calcific+aortic+valve+disease.">Hemodynamic and cellular response feedback in calcific aortic valve disease.</a> Circulation research. 113, 186-197 (2013).</li><li>Bosse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+nitric+oxide+signaling+regulates+Notch1+in+aortic+valve+disease.">Endothelial nitric oxide signaling regulates Notch1 in aortic valve disease.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. 60, 27-35 (2013).</li><li>Laforest, B., Andelfinger, G., Nemer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Gata5+in+mice+leads+to+bicuspid+aortic+valve.">Loss of Gata5 in mice leads to bicuspid aortic valve.</a> The Journal of clinical investigation. 121, 2876-2887 (2011).</li><li>Hofmann, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+deletion+of+murine+Jag1+leads+to+valve+calcification+and+congenital+heart+defects+associated+with+Alagille+syndrome.">Endothelial deletion of murine Jag1 leads to valve calcification and congenital heart defects associated with Alagille syndrome.</a> Development. 139, 4449-4460 (2012).</li><li>Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. H., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitral+valve+endothelial+cells+with+osteogenic+differentiation+potential.">Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 598-607 (2011).</li><li>Gould, R. A., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+valvular+endothelial+cells.">Isolation of valvular endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2010).</li><li>Butcher, J. T., Penrod, A. M., Garcia, A. J., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+morphology+and+focal+adhesion+development+of+valvular+endothelial+cells+in+static+and+fluid+flow+environments.">Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 24, 1429-1434 (2004).</li><li>Cheung, W. Y., Young, E. W., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+isolating+and+purifying+porcine+aortic+valve+endothelial+cells.">Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells.</a> The Journal of heart valve disease. 17, 674-681 (2008).</li><li>Motoike, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+GFP+reporter+for+the+study+of+vascular+development.">Universal GFP reporter for the study of vascular development.</a> Genesis. 28, 75-81 (2000).</li><li>Peacock, J. D., Lu, Y., Koch, M., Kadler, K. E., Lincoln, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spatial+expression+of+collagens+during+murine+atrioventricular+heart+valve+development+and+maintenance.">Temporal and spatial expression of collagens during murine atrioventricular heart valve development and maintenance.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 3051-3058 (2008).</li><li>Levay, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scleraxis+is+required+for+cell+lineage+differentiation+and+extracellular+matrix+remodeling+during+murine+heart+valve+formation+in+vivo.">Scleraxis is required for cell lineage differentiation and extracellular matrix remodeling during murine heart valve formation in vivo.</a> Circulation research. 103, 948-956 (2008).</li><li>Lincoln, J., Alfieri, C. M., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+and+FGF+regulatory+pathways+control+cell+lineage+diversification+of+heart+valve+precursor+cells.">BMP and FGF regulatory pathways control cell lineage diversification of heart valve precursor cells.</a> Developmental biology. 292, 292-302 (2006).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nfatc1+coordinates+valve+endocardial+cell+lineage+development+required+for+heart+valve+formation.">Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation.</a> Circulation research. 109, 183-192 (2011).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

نحن هنا وصف لأول مرة، وهي طريقة جديدة لعزل VECs الفئران الجنينية والكبار من الفئران Tie2-GFP. في حين أن هذا الخط الماوس استخدمت على نطاق واسع لعزل السكان الخلية البطانية، وهذا هو التقرير الأول يبين العزلة انتقائية من VECs. بسبب هشاشة من السكان مركزنا، وقد وضعنا بروتوكول صرامة التي تسمح لعزل خلية واحدة من GFP إيجابي (وGFP السلبية) صمامات القلب من خلايا الفئران الجنينية والكبار. مقارنة المنشور الأصلي باستخدام الأجنة أو الأعضاء كاملة من الفئران GFP Tie2-14، قمنا الأمثل كولاجيناز وتشريح الخطوات على أساس وفرة منخفضة من هذه الفئة من السكان الخلايا البطانية الهش لعزل السكان حدد من الخلايا. سبق فقط تم الإبلاغ عن العزلة مركزنا في نماذج حيوانية كبيرة مع الأدوات الوراثية والجزيئية البيولوجية محدودة. يتم وضع هذه الأدوات جيدا في الفئران وبالتالي فإن أبيعنه lity لعزل VECs الفئران يسمح لمجموعة موسعة من التصاميم التجريبية لاستخدامها في البحوث صمام القلب. ولذلك، ميزة كبيرة لهذا النهج هو أن VECs يمكن عزل زمنيا من نوع الفئران البرية، ونماذج من الأمراض والإصابات صمام. والميزة الثانية هي أن VECs يمكن عزل وتحليلها على الفور تقريبا بعد تشريح، والحفاظ على أنماط التعبير التي تعكس الوضع في الجسم الحي بشكل أكثر دقة. علاوة على ذلك، هذا البروتوكول العزلة كافية للقضاء على زراعة الخلايا للتوسع عدد والتغيرات المظهرية بالتالي المحتملة الناجمة عن البيئة في المختبر يتم منعها. على الرغم من المستجدات والفوائد التجريبية من هذا البروتوكول، ونحن ندرك أن القيود لا تزال موجودة. أولا، وحجم السكان مركزنا ضمن صمامات الفئران صغيرة جدا، وبالتالي، هناك حاجة إلى عدة الفضلات الجنينية في الوقت المناسب من أجل توليد RNA كافية لتحليل التعبير الجيني. بينما ثيق يمكن التغلب عليها باستخدام مربي متعددة، يمكن أن يكون لها تأثير على تطبيق بعض أدوات التحليل بعد العزلة. وكان هذا القيد تحديا بشكل خاص لتكوين الثقافات متموجة من VECs GFP إيجابية من أجل إجراء المزيد من التحليلات وافية من الظواهر مركزنا بما في ذلك التشكيلات الجزيئية والمقايسات الفنية. ولنعترف أن ليس كل الصعوبات التي تم التغلب على نهجنا ولكن هذا هو مجال اهتمام أننا نسعى إلى التغلب عليها. هذا النهج من عزل VECs من مناطق صمامي يقدم إمكانية حدوث تلوث من التعادل GFP خلايا -positive، غير صمامي البطانية من البطانة، أو هياكل الأوعية الدموية داخل عضلة القلب البطيني. حتى الآن، لم يتم التعرف التمييز الجزيئي للVECs من غيرهم من السكان الخلايا البطانية القلب. لكن منطقة محسن من الجين Nfatc1 تم التعرف وأظهرت لتسمية تحديدا VECs التي لاالخضوع EMT، وليس السكان الخلية البطانية الآخرين داخل القلب 18. كنموذج لجنة المساواة العرقية (Nfatc1 enCre) هو متاح، يمكن أن الدراسات المستقبلية الاستفادة من خصوصية هذا الخط لتقليل مخاطر التلوث. بالإضافة إلى خلايا إيجابية Tie2-GFP- غير صمامي، هناك دائما إمكانية حدوث تلوث من myocytes عند النقطة التي نعلق منشورات صمام إلى المنطقة الحلقي من الحاجز والجدران عضلة القلب الجدارية. في البيانات لا تظهر هنا، بدأنا في البداية دراسات لعزل VECs من مناطق صمامي تشريح باستخدام الخرز الأجسام المضادة مترافق مع المغلفة مكافحة GFP ومكافحة CD31. بينما كان هذا النهج الناجح لعزل الخلايا البطانية، عانينا من تكتل كبير من الخلايا المجاورة أنواع الخلايا، غير البطانية وبالتالي فيكس وخلايا عضلة القلب ملوثة العينة التجريبية لدينا. تم تجنب ذلك باستخدام تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية حيث تم تعيين المعلمات لعزل الوحيد تعليق خلية واحدةق وتحليل PCR للكشف تمت السيطرة التعبير عن الجينات العضلية محددة لهذا القيد (الشكل 3). بينما تلوث دينا يمكن اعتبار الحد الأدنى و، يبقى التعقيد التجريبي المحتملة التي يمكن تجنبها في المستقبل مع اختيار مزدوجة من GFP وعلامات سطح الخلية البطانية محددة. باستخدام هذا البروتوكول، لدينا VECs معزولة بنجاح من الفئران الجنينية والكبار وقدمت أمثلة للكيفية التي يمكن أن تستخدم هذا الأسلوب لعزل الحمض النووي الريبي والثقافة خلية GFP السكان الخلية الإيجابية والسلبية GFP. ومع ذلك، فإن هذا النهج لا يقتصر على هذه التطبيقات، ويمكن استخدامها لمجموعة كبيرة من الأساليب الجزيئية، الخلوية والوظيفية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون ولدت الخلفية Tie2-GFP مع نماذج الماوس الوراثية من شأنها أن تسمح للدراسات المقارنة للسكان VEC في الصحة والمرض. فإن تطوير هذه المنهجية الجديدة، لأول مرة، والسماح للدراسات مركزةدراسة مساهمة VECs في تطوير صمام وصيانة، ويمكن أن تكشف عن آليات تأخذ حقها من التقييم سابقا من مرض صمام تعتمد على البطانية.

ويتكون صمام ناضجة من ثلاث طبقات طبقية من المصفوفة خارج الخلية المتخصصة (ECM) تتخللها خلايا الخلالية صمام (فيكس) ومغلفة بطبقة واحدة من الخلايا البطانية صمام القلب (VECs) 1. دور ECM هو توفير جميع خصائص النشاط الحيوي اللازمة لتحمل التغيرات المستمرة في قوة الدورة الدموية أثناء دورة القلب. وينظم دوران ECM صمام في صمام الكبار بإحكام بواسطة فيكس التي هي هادئة إلى حد كبير ومثل الخلايا الليفية، في غياب المرض. بالإضافة إلى السكان VIC، والخلايا البطانية صمام القلب (VECs) تشكل البطانة دون انقطاع على سطح الشرفات صمام 2. في حين وصفت أهمية ECM وفيكس للهيكل صمام وظيفة من قبلنا وغيرها، ودور VECs أقل شهرة. ومع ذلك، هذه الفئة من السكان خلية صغيرة نسبيا هو أمر حاسم لتشكيل صمام في الجنين، ويتم وصفها بأنها مختلة في صمامالمرض. تشكيل صمام القلب في الجنين يبدأ عند مجموعة فرعية من الخلايا البطانية داخل المناطق القناة وتدفق القناة الأذينية البطينية تخضع البطانية إلى التحول الوسيطة (EMT) وشكل تورمات المعروفة باسم سائد شغافية 1،3. خلايا اللحمة المتوسطة تحولت حديثا ضمن هذه الهياكل تفرق في وقت لاحق إلى فيكس وتشكل صمامات ناضجة. مرة واحدة اكتمال EMT، والخلايا البطانية التي تحيط الوسائد، ويطلق VECs، تشكل طبقة الخلايا البطانية دون انقطاع يحمي صمام ناضجة ضد الاصابة. بالإضافة إلى ذلك، VECs بمعنى البيئة والدورة الدموية وقد ثبت أن جزيئيا التواصل مع فيكس الأساسي لتنظيم ECM التوازن 1،3. في الصمامات المريضة، تعطل أحادي الطبقة مركزنا بالتعاون مع تغيرات غير طبيعية في المؤسسة ECM والميكانيكا الحيوية غيرت 4،5. بالإضافة إلى ذلك، تشير الدراسات في نماذج الماوس التي خلل مركزنا هو السبب الكامن وراء صمام دisease 1،6-9. كما VECs تلعب دورا هاما في تطوير صمام، والصيانة، والمرض، فمن المهم أن نحدد تماما من الظواهر الزمنية من أجل المضي قدما الميدان وفهم آليات المرض. العمل السابق عدة مختبرات قد عزل بنجاح VECs من الخنازير والأغنام نماذج 10-12. نظرا لحجم كبير من هذه الصمامات، والعزلة من خلال ينظف و / أو الهضم الأنزيمي، تليها عدد من الأساليب المختلفة بما في ذلك العزلة المغناطيسي فصل خلية حبة وحيدة الخلية التوسع النسيلي كانت فعالة لتوليد السكان النقي 11-13. ومع ذلك، يمكن لهذه النماذج أن يكون مقيدا بسبب الشرح غير مكتمل من الخنازير والأغنام الجينوم الحد من توافر الأدوات الجزيئية بالإضافة إلى ارتفاع التكاليف. لذا التجريب من الخنازير والأغنام VECs بعد العزلة يمكن أن يكون تقييدا. نماذج الماوس هي المفضلة بسبب عدة احتمالات للmanipula الوراثيةنشوئها والأدوات الجزيئية في الجنين والكبار، ولكن حتى الآن، لم ترد تقارير عن العزلة مركزنا في النماذج الحيوانية الصغيرة. هذا هو الأرجح بسبب صعوبة العمل مع عينات الأنسجة الصغيرة التي تضم أقلية السكان الخلية التي تفتقر حاليا هوية فريدة من علامات مركزنا محددة، وبالتالي منع أساليب العزلة القائمة على الأجسام المضادة. في هذه المقالة، ونحن التقرير طريقة جديدة لعزل مباشرة من VECs الفئران في المراحل الجنينية والكبار. هذا البروتوكول يستفيد من الفئران Tie2-GFP، التي تعبر عن GFP في جميع أنواع الخلايا البطانية والتي استخدمت على نطاق واسع لدراسة السكان الخلية البطانية 14. ومع ذلك، فإن حداثة هذه الدراسة الحالية هي أن هذه الفئران، للمرة الأولى استخدمت لعزل الخلايا البطانية من الصمامات. عن طريق تشريح دقيق للأنسجة صمام وسلسلة من تسعة الهضم الأنزيمية تليها FACS الفرز، VECs يمكن عزلها واستخدامها لأساليب فنية تجريبية مختلفة فيبغرض اختتامها استخراج الحمض النووي الريبي والثقافة، مباشرة بعد الفرز.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>		
<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:107px;">A-11077</td>
			<td style="width:148px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">70 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td style="width:107px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:107px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">2.5% Trypsin</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:107px;">BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">CD31 rat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:107px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:107px;">553370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Chick Serum</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">16110-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">17104-019</td>
			<td>Prepared according to manufactuer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">DNase I, RNase free (10,000 Units)</td>
			<td style="width:107px;">Roche</td>
			<td style="width:107px;">4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">EBM-2</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:107px;">CC3156</td>
			<td>For VEC media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">EDTA, 0.5M Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Hoefer</td>
			<td style="width:107px;">03-500-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">EGM2 SingleQuot, Bulletkit</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:107px;">CC-4176</td>
			<td>For VEC media</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td style="width:107px;">Hyclone</td>
			<td style="width:107px;">SH3007103IH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:107px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Horse Serum</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">16050-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Hybridization Oven</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">230301V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Medium 199 1X</td>
			<td style="width:107px;">Corning Cell gro</td>
			<td style="width:107px;">10-060-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Paraformaldehyde 16% Solution EM grade</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:107px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Pen/Strep</td>
			<td style="width:107px;">MP-Biomed</td>
			<td style="width:107px;">ICN1670049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Permanox sterile chamber slide with cover</td>
			<td style="width:107px;">Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:107px;">177429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Phosphate-Buffered Saline, 1X</td>
			<td style="width:107px;">Corning Cell gro</td>
			<td style="width:107px;">21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">PrimeTime Mini qPCR Assay</td>
			<td style="width:107px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:107px;">Acta2 (&#945;SMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:107px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:107px;">4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">SuperScript VILO Mastermix</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">11755050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Tie2-GFP mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:107px;">3658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Tissue forceps #5 11cm</td>
			<td style="width:107px;">Dumont</td>
			<td style="width:107px;">14096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Trizol</td>
			<td style="width:107px;">Ambion</td>
			<td style="width:107px;">15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">&#945;-SMA anti-mouse antibody&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">A2547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:115px;">VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:107px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:107px;">H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine valve endothelial cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

خلايا Tie2-GFP توطين شارك مع علامات الخلايا البطانية في صمامات القلب الجنينية والكبار. من أجل تأكيد خصوصية Tie2-GFP التعبير في VECs من الفئران الجنينية والكبار، وقد أجريت المناعي لتحديد شارك في التعريب مع علامة الخلية البطانية، CD31 في أقسام الأنسجة المحضرة من E14.5 والكبار 3 أشهر من العمر Tie2-GFP الفئران باستخدام أساليب نشرت من قبل لدينا مختبر 16. كما هو مبين في الشكل 1، VECs شارك في التعبير عن GFP (الشكل 1 A، B، E، F) وCD31 (الشكل 1 C، D، E، F) في البالغين (الشكل 1 B، D، F) والجنينية ( الشكل 1 A، C، E) مراحل، وبالتالي التحقق من صحة نموذجنا للعزلة مركزنا اللاحقة. حدد تحليل FACS متميزة السكان الخلية GFP إيجابي وسلبي GFP في صمامات القلب الجنينية والبالغة المعزولة من الفئران Tie2-GFP. ر البريتم استخدام الفئران يب] C57 / BL6 لتعيين المعلمات GFP وحوالي 2٪ من الخلايا واحد بوابات من الفئران Tie2-GFP تظهر تخصيب كبير في الخلايا GFP إيجابية عن طريق تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية في كل من عينات الجنينية والكبار (الشكل 2). استنادا إلى دراسات شارك في التعريب هو مبين في الشكل 1، وتعتبر هذه الخلايا VECs وتسفر بمتوسط ​​61800 مجموع الخلايا (تتراوح عينات من خلايا 39،000-77،000 / عينة) في عينات الكبار (ن ​​= 3)، و8،928 الخلايا (8،015- 11،000 خلية / لتر) من القمامة واحدة من الأجنة E14.5. يؤكد تحليل PCR من علامات تخصيب الخلية البطانية في الخلايا GFP إيجابية وصمام علامات الخلايا الخلالي في خلايا GFP السلبي معزولة عن الفئران Tie2-GFP. تحليل الجينات التعبير عن GFP السكان الخلية الإيجابية والسلبية التي QPCR FACS التالية تظهر ملامح الجزيئية متميزة. مقارنة GFP السكان الخلية السلبية المعزولة من أجنة Tie2-GFP وأدولTS، وإثراء خلايا GFP إيجابية للتعبير عن البطانية علامات خلية CD31 وVWF، (الشكل 3). علاوة على ذلك، التعبير عن علامات العضلية (Myh6، Myh7) في هؤلاء السكان الخلية منخفض جدا، مما يدل على تلوث الأدنى من الخلايا غير البطانية. في المقابل، يتم إثراء خلايا GFP السلبية المعزولة من الكبار الفئران Tie2-GFP والأجنة E14.5 للصمام خلية الخلالي (VIC) علامات، وخلايا إيجابية α-SMA وPeriostin (POSTN) نسبة إلى GFP. إثراء هذه علامات أعلى في خلايا GFP السلبية المعزولة من عينات E14.5 مقارنة مع البالغين بسبب النمط الظاهري هادئة من فيكس الكبار والتعبير وبالتالي انخفاض علامات تفعيلها. GFP إيجابية الخلايا المعزولة من الفئران الكبار Tie2-GFP يمكن تربيتها في المختبر. تم فحص القدرة على ثقافة GFP خلايا الإيجابية والسلبية GFP المعزولة من عينات الكبار قاعدةد على مورفولوجيا الخلايا وتلطيخ المناعى. باستخدام بروتوكولات الموصوفة سابقا من قبلنا 17 نظهر في الشكل 4 أن الخلايا GFP إيجابية تظهر جولة في مورفولوجيا (الشكل 4A) وشارك في التعبير عن GFP مع علامة الخلية البطانية CD31 بعد أسبوعين في الثقافة (الشكل 4C). في المقابل، الخلايا غير البطانية سلبية لGFP، عرض مثل الوسيطة مورفولوجيا (الشكل 4B) والتعبير عن VIC علامة α-SMA بعد تسعة أيام (الشكل 4D). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig1highres.jpg" width="400" /> الرقم 1. خلايا Tie2-GFP إيجابية شارك تعريب مع CD31 في صمامات القلب الجنينية والكبار. المناعي لإظهار رابطة (Tie2-) GFP التعبير (A، B) مع علامة الخلية البطانية، CD31 (C، D) في قمنشورات eptal من الصمام التاجي في E14.5 (A، C، E) والكبار (B، D، F) مراحل. وسلط الضوء على المنطقة في صمام A، C، E. (E، F) الصور المدمجة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig2highres.jpg" width="500" /> ويمكن تحديد الشكل 2. VECs Tie2-GFP إيجابية من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية. بالمقارنة مع الضوابط C57 / BL6 العمر المتطابقة (A، C)، وصمامات عزل من أجنة Tie2-GFP (B) والكبار (D) تحتوي على GFP- متميزة السكان الخلية إيجابي، كما هو مبين باللون الأخضر. تم جمع الأحداث GFP سلبية، كما هو موضح باللون الأحمر كمجموعة تحكم. الأرقام في (B) و (D) تشير إلى متوسط٪ من GFP فخلايا ositive من إجمالي عدد الأحداث مرتبة حسب نظام مراقبة الأصول الميدانية (ن = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig3highres.jpg" width="500" /> يتم إثراء الشكل 3. خلايا GFP إيجابية للعلامات الخلايا البطانية في حين أن الخلايا GFP سلبية تعبر عن الجينات المرتبطة مع الخلايا الخلالي صمام. الممثل QPCR من علامات الخلايا البطانية (CD31، عامل فون ويلبراند (VWF)) والكبار (Myh6) والجنين ( Myh7) علامات العضلية في خلايا GFP إيجابية معزولة عن المناطق صمامي من E14.5 (A) والكبار (B) الفئران Tie2-GFP. ملاحظة إثراء علامات الخلية البطانية ومستويات منخفضة جدا من الجينات المرتبطة العضلية. (C، D) أضعاف تشاnges في التعبير عن صمام علامات الخلايا الخلالي α-SMA وPostn في خلايا GFP السلبي معزولة من E14.5 (C) والكبار (D) الفئران Tie2-GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig4highres.jpg" width="500" /> الرقم 4. خلايا Tie2-GFP إيجابية تحافظ التعبير عن علامات الخلايا البطانية في المختبر. بعد FACS، GFP إيجابي (A، C) والسلبية (B، D) سكان الخلية من الفئران الكبار والمثقفين حتى متموجة ويخضع للتخلص التصوير النقيض (A، B) والمناعية الفلورية (C، D). خلايا GFP إيجابية تعبر عن CD31 (أحمر) (C) بعد10 يوما للثقافة. في المقابل، لم يتم الكشف عن GFP التعبير في السكان الخلية السلبي الذي ملطخة إيجابية لα-SMA، علامة على تنشيط فيكس (D).

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Valve Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

عزل خلايا الفئران صمام غشائي

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

isolation-of-murine-valve-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K Views.  The Ohio State University. The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Video: Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

عزل خلايا الإنسان الوريد السري غشائي (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

العزلة وتوقعات بنمو كبير من الكبار الإنسان خلايا غشائي السلف تشكيل مستعمرة

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

عزل الخلايا البطانية صمامي

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

العزلة والثقافة في الخلايا البطانية الرئوي من الفئران حديثي الولادة

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

عزلة الجنينية البطيني الخلايا البطانية

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

عزل الفئران التاجي الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

عزل خلايا الفأر التاجي غشائي

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

عزل وثقافة الخلايا البطانية الأبهرية الأولية من الخنازير المصغرة

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) play an important role in the calcification process in aortic stenosis through the activation of their dedifferentiation program to osteoblast-like cells. Mouse VICs are a good in vitro tool for the elucidation of the signaling pathways driving the mineralization of the aortic valve cell. The method described herein, successfully used by these authors, explains how to obtain freshly isolated cells. A two-step collagenase procedure was performed with 1 mg/mL and 4.5 mg/mL. The first step is crucial to remove the endothelial cell layer and avoid any contamination. The second collagenase incubation is to facilitate the migration of VICs from the tissue to the plate. In addition, an immunofluorescence staining procedure for the phenotype characterization of the isolated mouse valve cells is discussed. Furthermore, the calcification assay was performed in vitro by using the calcium reagent measurement procedure and alizarin red staining. The use of mouse valve cell primary culture is essential for testing new pharmacological targets to inhibit cell mineralization in vitro.

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

This article describes the isolation of mouse aortic valve cells by a two-step collagenase procedure. Isolated mouse valve cells are important for performing different assays, such as this in vitro calcification assay, and for investigating the molecular pathways leading to aortic valve mineralization.

عزل خلايا الصمام الخلالي الماوس لدراسة تكلس الصمام الأبهري في المختبر

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...