يعرض هذا البروتوكول الخلايا السرطانية في التعليق لنبضات قصيرة من إجهاد القص السائل لمحاكاة جوانب معينة من كيفية تعرض الخلايا السرطانية النقيلية لقوى ديناميكية الدم أثناء وجودها في الدورة الدموية. بل هو تقنية بسيطة نسبيا لتطبيق نبضات وجيزة من ارتفاع مستوى الإجهاد القص السوائل. عند محاولة هذا البروتوكول، كن حذرا على الإبر غير المغطاة ولا ينحني لهم لأن هذا سوف يغير الضغط القص القوة المطبقة.
قد ينتج هذا الإجراء الهباء الجوي، لذلك استخدام تدابير السلامة المناسبة. للبدء، والإفراج عن 70 إلى 90٪ التقاء PC3 الخلايا من طبق زراعة الأنسجة عن طريق أسبيراتينغ متوسط النمو وغسل طبق 10 سم مع خمسة ملليلتر من الكالسيوم والمغنيسيوم خالية من برنامج تلفزيوني. ثم يستنشق برنامج تلفزيوني وإضافة ملليلتر واحد من 0.25٪ تريبسين.
بعد المحاولة ، لاحظ انفصال الخلايا تحت المجهر المقلوب. لمنع التريبسين، أضف خمسة ملليلترات من متوسط DMEM/F12 الذي يحتوي على 10٪ FBS. بعد ذلك، ضع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي وحدد تركيز الخلية وإجمالي عدد الخلايا.
الطرد المركزي تعليق الخلية في 300 × ز لمدة ثلاث دقائق، ثم يستنشق supernatant وإعادة إنفاق بيليه في وسيطة زراعة الأنسجة الخالية من المصل. قطع حول الجزء السفلي من أنبوب البوليسترين 14 ملليلتر في خط سبعة ملليلتر ووضع تعليق الخلية المختلطة في أنبوب قطع. جمع عينات التحكم ثابتة بشكل منفصل من الخلايا قبل التعرض الإجهاد القص السوائل لاستخدامها لإجراء المقايسات.
لتعريض عينة تعليق الخلية المتبقية لإجهاد القص السائل، ارسم تعليق الخلية في حقنة 5 ملليلتر وأرفق إبرة نصف بوصة قياس 30. ضع الحقنة وتأمينها بإبرة غير مغطاة على مضخة حقنة وحدد معدل التدفق لتحقيق المستوى المطلوب من إجهاد القص السائل. تشغيل مضخة حقنة وجمع عينة مقص في أنبوب قطع بزاوية 45 درجة تقريبا للحد من رغوة.
إزالة المحاقن بعناية من مضخة الحقن واستخدام كماشة لإزالة الإبرة، مع الحرص على عدم لمسها. كرر الإجراء حتى يتعرض تعليق الخلية للعدد المطلوب من نبضات إجهاد القص السائل. إجراء اختبارات الجدوى مع العينات الثابتة قبل تعريض الخلايا لإجهاد القص السائل.
لإجراء عمليات الفحص الأنزيمية، قم بنقل 100 ميكرولتر من العينات الثابتة المكررة إلى لوحة من 96 بئرا. ثم، جمع 100 ميكرولتر من العينات بعد التعرض للإجهاد القص السوائل ووضعها في لوحة 96 جيدا. إضافة 20 ميكرولتر من 0.15 ملليغرام لكل محلول ريسازورين ملليلتر لكل عينة بشكل جيد وإلى الآبار التي تحتوي على 100 ميكرولتر من المتوسطة وحدها.
احتضان لوحات البئر في حاضنة زراعة الأنسجة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين، ثم قياس الفلورسينس وامتصاص باستخدام قارئ لوحة والحصول على النسبة المئوية للخلايا قابلة للحياة من خلال مقارنة متوسط إشارة من كل من الإجهاد القص السوائل يتعرض عينات إلى المتوسط لعينة التحكم ثابت. وبالمثل، جمع aliquots من عينات ثابتة لإجراء قياس التدفق الخلوي والمقاايسات clonogenic كما هو موضح في المخطوطة النصية. في التحليل التمثيلي ، تم تقييم صلاحية الخلايا السرطانية الظهارية الثديية للخزعة السينجينية باستخدام تحويل الريسازورين بعد تعريض الخلايا لعدد من نبضات إجهاد القص السائل.
على الرغم من أن كل خط الخلية عرض ملامح المقاومة المختلفة، لم يكن هناك فرق كبير في الجدوى بعد 10 نبضات من التعرض للإجهاد القص السوائل. أظهرت خطوط الخلايا السرطانية الإضافية من مجموعة متنوعة من أصول الأنسجة قدرة أكثر من 20٪ على البقاء بعد 10 نبضات من إجهاد القص السائل ، باستثناء خلايا MIA PaCa-2 ، والتي أظهرت قدرة على البقاء أقل من 10٪ بسبب الحساسية تجاه التدمير الميكانيكي من إجهاد القص السائل. عند جمع العينة الثابتة قبل تطبيق ضغط القص السوائل، تأكد من أن تعليق الخلية مختلط بشكل متجانس.
إزالة الإبرة بعناية مع كماشة ولا ينحني أو لمس الإبرة. بالإضافة إلى قياس صلاحية الخلية، يمكن للمرء تقييم التغيرات في التعبير الجيني، وإشارات الخلايا، والانتشار، والهجرة. باستخدام هذا كنموذج للتعرض لإجهاد القص السائل ، يمكن للمرء دراسة كل من كيفية مقاومة الخلايا السرطانية للتدمير عن طريق إجهاد القص السائل وتقييم آثار إجهاد القص السائل على بيولوجيا الخلايا السرطانية.
وقد استخدمت هذه التقنية من قبل مختبرنا وغيرها لاستكشاف آثار الإجهاد القص السوائل على الخلايا السرطانية المتداولة. وقد أظهرت هذه الدراسات أن الإجهاد القص السائل يغير بسرعة الخصائص الميكانيكية للخلايا السرطانية، وأن هذا يساهم في قدرة الخلايا السرطانية على مقاومة الدمار عن طريق الإجهاد القص السوائل.
