Этот протокол подвергает раковые клетки в суспензии коротким импульсам напряжения сдвига жидкости, чтобы имитировать определенные аспекты того, как метастатические раковые клетки подвергаются воздействию гемодинамических сил, пока они находятся в кровеносной системе. Это относительно простой метод применения коротких импульсов высокого уровня напряжения сдвига жидкости. При попытке этого протокола будьте осторожны на неограниченных иглах и не сгибайте их, так как это изменит приложенную силу сдвига напряжения.
Эта процедура может производить аэрозоли, поэтому используйте соответствующие меры безопасности. Для начала выпустите от 70 до 90% слиющихся клеток PC3 из чашки для культуры тканей, аспирируя питательную среду и промывая 10-сантиметровую посуду пятью миллилитрами PBS без кальция и магния. Затем аспирируют PBS и добавляют один миллилитр 0,25% трипсина.
После трипсинизации наблюдают за отслоением клеток под инвертным микроскопом. Чтобы ингибировать трипсин, добавьте пять миллилитров среды DMEM/F12, содержащей 10% FBS. Затем поместите клеточную суспензию в коническую трубку и определите концентрацию клеток и общее количество клеток.
Центрифугируют клеточную суспензию при 300 х г в течение трех минут, затем аспирируют супернатант и повторно суспендируют гранулу в безсыворочной тканевой культурной среде. Нарежьте вокруг дна 14-миллилитровой полистирольной трубки на линии семи миллилитров и поместите суспензию смешанной ячейки в разрезанную трубку. Отдельно соберите статические контрольные образцы клеток перед воздействием напряжения сдвига жидкости для использования для выполнения анализов.
Чтобы подвергнуть оставшийся образец клеточной суспензии воздействию напряжения сдвига жидкости, втяните клеточную суспензию в пятимиллилитровой шприц и прикрепите полудюймовую иглу 30 калибра. Поместите шприц без купированной иглы на шприцевом насосе и установите скорость потока для достижения желаемого уровня напряжения сдвига жидкости. Запустите шприцевой насос и соберите срезанный образец в разрезанной трубке под углом примерно 45 градусов, чтобы уменьшить вспенивание.
Осторожно извлеките шприц из шприцевого насоса и используйте плоскогубцы, чтобы удалить иглу, заботясь о том, чтобы не коснуться ее. Повторяйте процедуру до тех пор, пока клеточная суспензия не подверглась воздействию нужного количества импульсов напряжения сдвига жидкости. Выполните анализы жизнеспособности со статическими образцами, прежде чем подвергать клетки воздействию напряжения сдвига жидкости.
Для ферментативных анализов перенесите 100 микролитровых аликвот из статических образцов в дубликате в 96-луночную пластину. Затем соберите 100 микролитров образцов после воздействия напряжения сдвига жидкости и поместите их в 96-луночную пластину. Добавьте 20 микролитров 0,15 миллиграмма на миллилитр раствора ресазурина в каждую пробную лунку и в скважины, содержащие 100 микролитров только среды.
Инкубируйте пластины скважины в инкубаторе культуры тканей 37 градусов Цельсия в течение двух часов, затем измеряйте флуоресценцию и поглощение с помощью считывателя пластин и получайте процент жизнеспособных клеток, сравнивая средний сигнал от каждого из образцов, подвергшихся воздействию напряжения сдвига жидкости, со средним и статическим контрольным образцом. Аналогичным образом, соберите аликвоты из статических образцов для выполнения проточной цитометрии и клоногенных анализов, как описано в текстовой рукописи. В репрезентативном анализе жизнеспособность сингенной биопсии эпителиальных раковых клеток молочной железы оценивали с использованием конверсии ресазурина после воздействия на клетки ряда импульсов напряжения сдвига жидкости.
Несмотря на то, что каждая клеточная линия демонстрировала различные профили сопротивления, не было существенной разницы в жизнеспособности после 10 импульсов воздействия напряжения сдвига жидкости. Дополнительные линии раковых клеток из различных тканевых источников продемонстрировали жизнеспособность более 20% после 10 импульсов напряжения сдвига жидкости, за исключением клеток MIA PaCa-2, которые показали жизнеспособность менее 10% из-за чувствительности к механическому разрушению от напряжения сдвига жидкости. При сборе статического образца перед применением жидкостей напряжения сдвига убедитесь, что клеточная суспензия однородно перемешана.
Осторожно удалите иглу плоскогубцами и не сгибайте и не прикасайтесь к игле. В дополнение к измерению жизнеспособности клеток, можно оценить изменения в экспрессии генов, клеточной сигнализации, пролиферации и миграции. Используя это в качестве модели воздействия напряжения сдвига жидкости, можно изучить, как раковые клетки сопротивляются разрушению напряжением сдвига жидкости, так и оценить влияние напряжения сдвига жидкости на биологию раковых клеток.
Этот метод был использован нашей лабораторией и другими для изучения влияния стресса сдвига жидкости на циркулирующие опухолевые клетки. Эти исследования показали, что напряжение сдвига жидкости быстро изменяет механические свойства раковых клеток и что это способствует способности раковых клеток противостоять разрушению жидким напряжением сдвига.
