Bu protokol, metastatik kanser hücrelerinin dolaşım sistemindeyken hemodinamik güçlere nasıl maruz kaldıklarına dair belirli yönleri taklit etmek için bir süspansiyondaki kanser hücrelerini kısa sıvı kesme stresi darbelerine maruz bırakır. Üst düzey sıvı kesme stresinin kısa darbelerini uygulamak nispeten basit bir tekniktir. Bu protokolü denerken, uncapped iğneler üzerinde dikkatli olun ve bu uygulanan kuvvet kesme stresini değiştireceğinden onları bükmeyin.
Bu prosedür aerosol üretebilir, bu nedenle uygun güvenlik önlemlerini kullanın. Başlamak için, büyüme ortamını emerek ve 10 santimetrelik kabı beş mililitre kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile yıkayarak doku kültürü çanaktan% 70 ila 90 uyumlu PC3 hücrelerini serbest bırakın. Ardından, PBS'yi aspire edin ve %0,25 trypsin mililitre ekleyin.
Trypsinization sonrası, ters mikroskop altında hücrelerin dekolnasını gözlemleyin. Trypsin'i inhibe etmek için%10 FBS içeren beş mililitre DMEM/F12 ortamı ekleyin. Daha sonra, hücre süspansiyonu konik bir tüpe yerleştirin ve hücre konsantrasyonu ve toplam hücre numarasını belirleyin.
Hücre süspansiyonu 300 x g'da üç dakika santrifüjleyin, sonra süpernatantı epire edin ve peletin serumsuz bir doku kültürü ortamında yeniden dirildi. Yedi mililitrelik çizgide 14 mililitre polistiren tüpün altını kesin ve karışık hücre süspansiyonunu kesme tüpüne yerleştirin. Test yapmak için sıvı kesme gerilme maruziyeti olmadan önce hücrelerin statik kontrol örneklerini ayrı olarak toplayın.
Kalan hücre süspansiyonu örneğini sıvı kesme stresine maruz bırakmak için, hücre süspansiyonu beş mililitrelik bir şırıngaya çekin ve 30 kalibre yarım inçlik bir iğne takın. Şırıngayı bir şırınga pompasına uncapped bir iğne ile yerleştirin ve sabitleyin ve istenen sıvı kesme stresi seviyesine ulaşmak için akış hızını ayarlayın. Şırınd pompasını çalıştırın ve köpürmeyi azaltmak için kesilmiş numuneyi kesme tüpünde yaklaşık 45 derecelik bir açıyla toplayın.
Şırıngayı şırınga pompasından dikkatlice çıkarın ve iğneyi çıkarmak için penseyi kullanın, dokunmamaya dikkat edin. Hücre süspansiyonu istenen sayıda sıvı kesme stresine maruz kalana kadar işlemi tekrarlayın. Hücreleri sıvı kesme stresine maruz kalmadan önce statik örneklerle canlılık tahlilleri gerçekleştirin.
Enzymatic tahliller için, 100 mikroliter aliquots'u statik örneklerden 96 kuyu plakasına aktarın. Daha sonra, sıvı kesme stresine maruz kalmadan sonra 100 mikrolitre numune toplayın ve bunları 96 kuyulu bir tabağa yerleştirin. Her numune kuyusuna ve sadece 100 mikrolitre orta içeren kuyulara mililitre başına 0,15 miligram resazurin çözeltisinin 20 mikrolitresini ekleyin.
Kuyu plakalarını 37 santigrat derece doku kültürü inkübatöründe iki saat kuluçkaya yatırın, ardından bir plaka okuyucu kullanarak floresan ve emiciliği ölçün ve sıvı kesme stresi maruz kalan örneklerin her birinden gelen ortalama sinyali statik kontrol örneğine karşılaştırarak uygulanabilir hücrelerin yüzdesini elde edin. Benzer şekilde, metin elyazmasında açıklandığı gibi akış sitometrisi ve klonojenik tahlilleri gerçekleştirmek için statik örneklerden aliquots toplayın. Temsili analizde, hücreleri bir dizi sıvı kesme stres darbesine maruz kaldıktan sonra resazurin dönüşümü kullanılarak singeneik biyopsi meme epitel kanseri hücrelerinin uygulanabilirliği değerlendirildi.
Her hücre hattında farklı direnç profilleri görüntülenmekle birlikte, 10 darbeli sıvı kesme stresinden sonra canlılıkta önemli bir fark yoktu. Çeşitli doku kökenlerinden gelen ek kanser hücresi çizgileri, sıvı kesme stresinden kaynaklanan mekanik tahribata karşı duyarlılık nedeniyle% 10'dan daha az bir canlılık gösteren MIA PaCa-2 hücreleri hariç, 10 sıvı kesme stresinden sonra% 20'den fazla canlılığı göstermiştir. Sıvı kesme stresi uygulamadan önce statik numuneyi toplarken, hücre süspansiyonun homojen bir şekilde karıştırıldığından emin olun.
İğneyi pense ile dikkatlice çıkarın ve iğneyi bükmeyin veya dokunmayın. Hücre canlılığını ölçmenin yanı sıra gen ekspresyasyonu, hücre sinyali, çoğalma ve göçteki değişiklikler de değerlendirilebilir. Bunu sıvı kesme stresine maruz kalmanın bir modeli olarak kullanarak, hem kanser hücrelerinin sıvı kesme stresi ile yıkıma nasıl direndiğini inceleyebilir hem de sıvı kesme stresinin kanser hücrelerinin biyolojisi üzerindeki etkilerini değerlendirebilir.
Bu teknik laboratuvarımız ve diğerleri tarafından sıvı kesme stresinin dolaşımdaki tümör hücreleri üzerindeki etkilerini araştırmak için kullanılmıştır. Bu çalışmalar, sıvı kesme stresinin kanser hücrelerinin mekanik özelliklerini hızla değiştirdiğini ve bunun kanser hücrelerinin sıvı kesme stresi ile yıkıma karşı koyma yeteneğine katkıda bulunduğunu göstermiştir.
