في هذا البروتوكول، نحن لا نقدم فقط شرحا مفصلا لكل خطوة من خطوات دمج وحدة EDU واحتواء المناعة، ولكن أيضا نشرح الحصول على الصور ومعالجة الصور وتقديم بعض النصائح لتحليل مجموعات البيانات الكبيرة. تسمح هذه التقنية لتخصيص الخلايا في G1 و S و M مراحل. وسيكون هذا مفيدا بشكل خاص لتحليل دورة الخلية على الدراسات المتعلقة بالطفرات غير التي تؤثر على الجينات الميتوتيكية.
نتوقع من الناس أن يكافحوا لمدة شهرين إلى ثلاثة أشهر إذا لم يكن لديهم معرفة مسبقة أو خبرة في هذه التقنية. للبدء ، أضف وسيط تشريح شنايدر أو SM إلى منخفضين متتاليين من لوحة بقعة اللمعان وإضافة PBS إلى الاكتئاب اللاحق. باستخدام زوج من ملقط، واختيار تجول يرقات نجمة الثالثة ووضعها على نسيج ملطخة برنامج تلفزيوني لتنظيف بقايا الطعام يطير.
ضع اليرقة في الاكتئاب مع PBS متبوعة بالاكتئاب المتتالي الذي يحتوي على SM. بعد ذلك تحت مجهر تشريح ، استخدم ملقط ناعم لإزالة ثلاثة أرباع الجزء السفلي من الجسم من اليرقة. ثم الاستيلاء بلطف على خطاطيف الفم اليرقات مع زوج واحد من ملقط وعقد لطيف من الطرف الآخر مع الزوج الآخر من ملقط. بدوره رأس اليرقات من الداخل الى الخارج عن طريق دفع خطاطيف الفم إلى الداخل وتقشير في وقت واحد قبالة الأنسجة في الطرف الآخر.
مراقبة الدماغ اليرقات مع أقراص التصوير المرفقة. إزالة الأنسجة الأخرى المرتبطة الدماغ ونقل الدماغ إلى الاكتئاب المتتالية اللاحقة مع SM. إضافة 100 ميكرولتر من 100 ميكرومولار EDU SM حل للاكتئاب آخر على لوحة Pyrex واحتضان ما يقرب من 5 إلى 10 تشريح العقول في هذا الحل لمدة 2 ساعة في 25 درجة مئوية. بعد التثبيت والتضمين المناعي إزالة PBST وإضافة كوكتيل الكشف عن EDU إلى العقول تشريح.
ثم احتضانها في درجة حرارة الغرفة في الظلام على خصية. بعد 30 دقيقة، اغسل العينات مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق لكل غسل في الظلام. لتلطيخ الحمض النووي، وإعداد 5 ميكروغرام لكل محلول Hoechst 33342 ملليلتر.
إزالة PBST بعد غسل الثاني وإضافة 500 ميكرولتر من الحل Hoechst إلى العقول تشريح، ثم احتضانها في الظلام. بعد 10 دقائق، قم بإزالة Hoechst وغسل العينات باستخدام PBST لمدة 10 دقائق. اضغط على الأنبوب على مقاعد البدلاء المختبر والسماح للأدمغة يستقر.
إزالة برنامج تلفزيوني من الأنبوب، تاركا وراءه 50 إلى 100 ميكرولتر. قطع نهاية تلميح micropipet 200 ميكرولتر واستخدامه لنقل العقول على شريحة زجاجية نظيفة. قم بإزالة الوصول إلى PBST من الشريحة عن طريق نقعه بشرائط ورق التصفية.
لا تدع ورقة التصفية تلمس الأدمغة. وضع قطرة من الماء للذوبان، غير مفلور تصاعد المتوسطة على العقول وتوجيه العقول بحيث يواجه الحبل العصبي البطني الشريحة والفص الوجه صعودا. ترتيب العقول في ملف واحد بحيث يكون من الأسهل لتصوير العقول بشكل متسلسل.
ضع بلطف زلة غطاء على رأس الدماغ واحتضان الشريحة بين عشية وضحاها في 2-6 درجات مئوية. من برنامج الاستحواذ حدد الهدف 63 مرة. وضع قطرة من زيت الغمر على الغطاء زلة فقط فوق العقول التي شنت لجعله أسهل لتحديد موقع الأنسجة من خلال العدسة.
باستخدام قناة dappy Hoechst 33342 ، ابحث عن الدماغ من خلال العدسة ثم انتقل إلى وضع الاستحواذ في البرنامج. إعداد 4 قنوات لتصوير Hoechst 33342، اليكسا الكلمة 4 8 8، اليكسا الكلمة 5 6، 8، واليكسا الكلمة 6 4 7. استخدام أداة مساعد صبغ لإعداد تلقائيا الليزر الإثارة الأصباغ المختارة والمرشحات الانبعاثات.
تعيين مجال الرؤية، بحيث أنه يشمل فص الدماغ بأكمله. صورة الحجم الكامل للفص الدماغ عن طريق الحصول على هذه الضريبة متباعدة 0.8 ميكرون وبصرف النظر. تخزين كافة الصور من جلسة تصوير بتنسيق مكتبة L I F نقطة.
لتحليل الصور، افتح فيجي، ثم اسحب ملفات LIF وأسقطها في فيجي. حدد مستعرض البيانات من علامة التبويب عرض المكدس واستخدم المكدس الظاهري من علامة التبويب إدارة الذاكرة في المكون الإضافي للتنسيقات الحيوية. مراقبة الصورة متعددة القنوات المعروضة في الصورة J.Change لون القنوات من شريط القائمة، وذلك باستخدام الصورة واللون، وأداة القنوات.
ورصد ميراندا المسمى الخلايا العصبية، والتي تظهر كخلايا مستديرة كبيرة في منطقة الدماغ المركزية. رسم منطقة الاهتمام باستخدام أداة القطع الناقص على كل neuroblast لتجنب عد neuroblast مرتين. من شريط القائمة J للصورة، حدد التحليل والأدوات ومدير عائد الاستثمار.
ضع علامة على جميع الخلايا العصبية في القسم Z الحالي واضغط على T بعد وضع علامة على كل خلية. بمجرد وضع علامة على جميع الخلايا العصبية في القسم Z الحالي ، قم بتغيير القنوات إلى pH3 و EDU واحص يدويا عدد الخلايا العصبية الإيجابية EDU ، والخلايا العصبية الإيجابية pH3 ، وEDU وpH3 الخلايا العصبية الإيجابية ، والخلايا العصبية التي لا تلطخ لأي علامة. البحث عن الخلايا العصبية وأقسام Z اللاحقة، وحذف ROIs القديمة وإضافة ROIs جديدة لحساب الخلايا العصبية في أكوام مختلفة.
إعداد جدول وحساب النسب المئوية للخلايا العصبية الموجودة في جميع الفئات الأربع لكل فص. قم بإعداد رسم بياني شريطي باستخدام برنامج جداول البيانات، يعرض بيانات التجمعات بالنسبة المئوية للخلايا العصبية في كل فئة. تظهر هنا الخلايا العصبية المركزية للدماغ من أدمغة يرقات النجوم الثالثة المعلمة ميراندا وEDU وpH3.
وخصصت الخلايا لمراحل G1/G0 وS وSG2/M و M. في تحليل EDU pH3 ، تم العثور على نسبة أعلى بكثير من MMS19 ، وفقدان الخلايا العصبية وظيفة في المرحلة M مقارنة مع الخلايا العصبية البرية نوع. MMS19: التعبير eGFP في فقدان MMS19 من خلفية وظيفة إنقاذ نسبة الخلايا في المرحلة M إلى مستويات نوع البرية.
من المهم عدم استخدام الأدمغة التالفة للخطوات اللاحقة. وينبغي إعداد حل ED طازجا قبل البدء في التشريح. يمكن استخدام هذا الأصل كفحص أولي سريع لتحديد العيوب في مراحل دورة الخلية المحددة.
ويمكن بعد ذلك متابعة ذلك بتحليل أكثر تفصيلا لمرحلة معينة.
