فإن الكتاب أن نعترف الدكتور فيليب H. شوارتز من العصبية الوطنية الجذعية البشرية الموارد خلية في مستشفى للأطفال ، أورانج كاونتي معهد البحوث لتوفير hNSPC الثقافات والدكتور غاري Bassell في جامعة إيموري للتعليم الأولي في تقنية تلوين parafilm.

اليوم 1 : خلايا إعداد Coverslips زجاج الألمانية والبذر ملاحظة : coverslips الزجاج الألماني غالبا ما تكون الأفضل لزراعة الخلايا الجذعية الأولية العصبي والخلايا العصبية. نحن نستخدم بروتوكول التنظيف التالية لتحسين التصاق الخلايا وانتشارها. coverslips الموقف في رف صغير من شأنها أن تسمح بالوصول السائلة إلى جانبي ساترة. الأولى ، في احتضان coverslips Liquinox 1 ٪ لمدة 10 دقيقة ، تليها 3 يغسل بماء منزوع الأيونات. تأكد من عدم وجود فقاعات الصابون لا تزال قائمة. المقبل ، وقسائم في احتضان حمض الهيدروكلوريك 1M لمدة 30 دقيقة ، تليها 3 يغسل بماء منزوع الأيونات. coverslips الجافة على 65 درجة مئوية خلال الليل. coverslips نقل إلى صحن الزجاج وتعقيم لتعقيم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هود في نسيج الثقافة والمكان في لوحة coverslips العقيمة بئر بحجم مناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips معطف مع laminin للالتصاق الخلية. coverslips احتضان في 10 ميكروغرام / مل بولي D - يسين (PDL) في الماء المعقم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة coverslips PDL واحتضانها في 20 ميكروغرام / مل في laminin EMEM لمدة 4 ساعات ، أو بين عشية وضحاها ، في 37 درجة مئوية نسيج الثقافة الحاضنة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاحظة : يرجى الرجوع إلى الإنسان الركض الخلايا الجذعية العصبية المادة ( <a href="/index/Details.stp?ID=263">https://www.jove.com/index/Details.stp؟ID=263</a> ) والإنسان العصبية العد المادة الخلايا الجذعية ( <a href="/index/Details.stp?ID=262">https://www.jove.com / مؤشر / Details.stp؟ ID = 262</a> ) لمعرفة كيفية resuspend hNSPCs والعد. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف laminin المغلفة coverslips مع برنامج تلفزيوني والبذور في كل الخلايا التي تحتوي على ساترة البئر على كثافة معينة (ونحن غالبا ما تستخدم في كثافة الطلاء الأولي 100،000-300،000 خلية / مل لخلايا أننا الطلاء لimmunostaining). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة مكان في 37 درجة مئوية نسيج الثقافة الحاضنة ويسمح للخلايا التمسك coverslips (عادة ما لا يقل عن 4 ساعات هو مطلوب). </li></ol> اليوم 2 : إصلاح ، Permeabilizing ، حجب ، وإضافة إلى خلايا جسم الابتدائية ملاحظة : نحن نستخدم ما يلي تثبيتي بارافورمالدهيد 4 ٪ للحفاظ على مورفولوجيا الخلايا. وصفة يتضمن الانتقال الرقم الهيدروجيني للسماح للبارافورمالدهيد للذهاب الى حل. نحن نفضل هذه الطريقة بدلا من استخدام الحرارة لإذابة بارافورمالدهيد بسبب ارتفاع درجات الحرارة يمكن أن يؤدي إلى توليد حمض الفورميك ، والتي يمكن أن تزيد تلوين الخلفية عند استخدام مضان. بعض المكونات من العون للحفاظ على هيكل تثبيتي هيكل الخلية (2 و MgCl EGTA) ، بينما تساعد على الحفاظ على التشكل العام (السكروز). 4 ٪ لامتصاص العرق تثبيتي للخلايا <table style="border-collapse: collapse; border: medium none;text-align:right;direction:rtl" border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> الكواشف والخطوات التالية : </td><td> مبلغ 100 مل من تثبيتي : </td></tr><tr><td> MilliQ المياه </td><td> 75 مل </td></tr><tr><td> بارافورمالدهيد (تزن في غطاء الدخان) </td><td> 4 ز </td></tr><tr><td> 10N هيدروكسيد الصوديوم ، وإثارة وإضافة قطرة قطرة حتى حل يزيل </td><td> حسب الحاجة </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> 10 مل </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 0.5 مل </td></tr><tr><td> 0.5 M EGTA </td><td> 2 مل </td></tr><tr><td> السكروز </td><td> 4 ز </td></tr><tr><td> 6N حمض الهيدروكلوريك ، يعاير إلى الرقم الهيدروجيني 7.4 </td><td> حسب الحاجة </td></tr><tr><td> MilliQ المياه </td><td> يرتفع الى 100 مل </td></tr><tr><td colspan="2"> المحل في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع. الحارة إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام </td></tr></tbody></table><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على مقاعد البدلاء ، وإزالة وسائل الاعلام وإضافة تثبيتي prewarmed. لاحتضان 5-15 دقائق (اعتمادا على أن يتم الكشف عن مستضد ، ونحن نستخدم عادة 10 دقيقة). وتنفيذ هذه الخطوات التالية في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل تثبيتي في وعاء مناسب ، والتعامل مع العديد من المؤسسات بارافورمالدهيد كنفايات خطرة. غسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني ، 5 دقائق في كل مرة. عند إزالة الحلول من الخلايا ، وتوخي الحذر بأن الشفط لا تجف الخلايا. أيضا ، يكون دائما الحل في متناول اليد المقبل إضافة إلى إزالة الخلايا قبل الحل الذي المعاطف لهم حتى لا تترك لتجف الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان داخل الخلية مستضد المصالح ، يجب أن تكون غشاء الخلية منفذة للسماح بدخول الأجسام المضادة. لpermeabilize الخلايا ، استخدام الطازجة بنسبة 0.3 ٪ تريتون X - 100 الحل في برنامج تلفزيوني. ماصة ببطء لأن تريتون هو لزج ، وتأكد هو تتفكك المنظفات في برنامج تلفزيوني قبل إضافة إلى الخلايا. Permeabilize الخلايا لمدة 5 دقائق ، ثم غسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني ، 5 دقائق في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويجب أن يعامل الخلايا مع وكيل لمنع عرقلة غير محددة وملزمة من الأجسام المضادة. نستخدم ألبومين المصل البقري (BSA) كعامل حظر. يتم حجب الحل عن طريق إذابة BSA 5 ٪ في برنامج تلفزيوني (على الروك أو المدورة لأنه يستغرق وقتا طويلا في حل) تصفية ثم سولution مع فلتر حقنة 0.45 ميكرون. كتلة الخلايا في حل جيش صرب البوسنة / PBS 5 ٪ لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li></ol> تمييع الضد الأساسي (الذي هو المأمول محددة للبروتين من الفائدة) إلى تركيز محدد مسبقا في 1 ٪ BSA / PBS (أعدها التخفيف من 5 ٪ BSA / PBS). مكان المخفف الضد الابتدائي (30 ميكرولتر في ساترة 25 مم ، 20 ميكرولتر في ساترة 18 مم و 15 مم ساترة لكل ميكرولتر 12) على لوحة زجاجية مغطاة parafilm. التقط ساترة مع الخلايا الثابتة ، عكس هذه الخلايا التي وجهها لأسفل ، ووضع ذلك على الضد حل بحيث الخلايا على اتصال مع الأجسام المضادة. وضع الشريط parafilm الثاني على بناء بأكملها. احتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل. يوم 3 : الغسل ، الحضانة جسم الثانوية ، وصمة عار النووية والتركيب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشريط بعناية parafilm العلوي والتقط ساترة ، عكس ذلك ، ووضعه مرة أخرى إلى لوحة مع برنامج تلفزيوني في كل يغسل جيدا لدرجة أن الخلايا هي مواجهة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني ، 5 دقائق في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الأضداد الثانوية التي من شأنها الكشف عن الأجسام المضادة الأولية ، على سبيل المثال ، إذا كان أدلى الضد الأساسي في الأرانب ، والأجسام المضادة الثانوية يجب أن تعترف الأرنب مفتش الحكومة. الحرص على تطابق أيضا isotype الأضداد (IgG والغلوبولين المناعي ، الخ). إذا باستخدام الأجسام المضادة الأولية متعددة ، تأكد من أنها من الأنواع المختلفة أو isotypes ، والكشف عن خطة لمع علامات مختلفة تعلق على الأجسام المضادة الثانوية. على سبيل المثال ، هل يمكن استخدام يقترن المضادة للأرنب ثانوية لfluorophore الحمراء مع جانب ضد الماوس ثانوية لfluorophore الخضراء. احتضان الخلايا في الجسم المضاد الثانوي حل المخفف إلى التركيز المناسب في جيش صرب البوسنة 1 ٪ لمدة 2 ساعة في الظلام في درجة حرارة الغرفة ، وذلك باستخدام تقنية لنفس الابتدائية (الخطوات لا يظهر في شريط الفيديو). قد حجم الأجسام المضادة الثانوية اللازمة لحضانة يكون أكبر قليلا من تلك التي للأجسام المضادة الأولية إذا تم تخزين ثانوية كحل الجلسرين (40 ميكرولتر في ساترة 25 مم و 30 مم ساترة ميكرولتر في 18 و 25 ميكرولتر في ساترة 12 ملم) . <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاحظة : إذا كنت تستخدم جزيئات الفلورسنت لتصور الجسم المضاد الثانوي ، ويجب أن يكون نموذج محمية من الضوء مرة واحدة تم إضافة الجسم المضاد الثانوي. احتضان في الظلام ، أو في لوحة احباط المغطاة. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية coverslips من parafilm صفه للجسم الأساسي. غسل الخلايا 2 مرات مع برنامج تلفزيوني ، 5 دقائق في كل مرة ، يليه في الحضانة 1 دقيقة 2 ميكروغرام / مل النووية هويشت صمة مخففة في برنامج تلفزيوني (إذا كان يفضل ملون مباين النووية). إذا كان وصمة عار هويشت قديمة والإشارة قاتمة جدا ، ويمكنك زيادة فترة حضانة و / أو تركيز. بعد حضانة مع هويشت ، ويغسل 1 الوقت مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن يتم تنظيمها coverslips على شريحة متزايدة مع وسائل الاعلام عن التصور على المجهر. في الحالات التي يتم استخدام جزيء نيون للتصور من الأجسام المضادة الثانوية ، يجب أن تحتوي على وسائل الاعلام المتزايدة للحد من عوامل photobleaching. نحن نستخدم وسائل الاعلام بوصفها Vectashield متزايدة لمضان. مكان هبوط الحجم المناسب للVectashield على شريحة المجهر (12 ميكرولتر في ساترة 25 مم و 6 لكل ميكرولتر ساترة 18 مم و 3 مم ساترة لكل ميكرولتر 12). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار بعناية وساترة وشطف الظهر مع الماء منزوع الأيونات لإزالة الأملاح (من برنامج تلفزيوني). وضع الداب قبالة المياه الزائدة على kimwipe أو منشفة ورقية ، وعلى قطرة Vectashield مع خلايا أسفل. ضع ساترة على بزاوية والسماح لتنحدر ببطء لتجنب فقاعات الهواء محاصرة. تسمية الشريحة مع التاريخ ، وأية معلومات العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح الشرائح مع coverslips حتى يجف (في الظلام) شفط ثم قبالة Vectashield الزائدة من حول حافة ساترة. ويمكن الآن حواف ساترة تكون مختومة مع طلاء الأظافر ، إذا كان المطلوب (مفيدة خصوصا إذا كان سيتم عرضها على coverslips المجهر المقلوب). وعادة ما نقوم بتخزين الشرائح لدينا في الفريزر -20 درجة مئوية. </li></ol>

<ol>
	<li>Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamin+A,+the+Arp2/3+complex,+and+the+morphology+and+function+of+cortical+actin+filaments+in+human+melanoma+cells.">Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells.</a> J. Cell Biol. 155, 511-518 (2001).</li><li>Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins.">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).</li><li>Flanagan, L. A., Ziaeian, B., Palmer, T., Schwartz, P. H., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+analysis+of+stem+cells.">Immunocytochemical analysis of stem cells.</a> In Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. , (2007).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passaging+Human+Neural+Stem+Cells.">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+Human+Neural+Stem+Cells.">Counting Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).</li></ol>

يصف هذا البروتوكول إجراء immunostaining hNSPCs لأنه يقلل من حجم الأجسام المضادة الضرورية ويعطي موثوقة تلوين الخلية. الإجراء كما هو موضح هو أفضل لمستضدات الخلايا ، ولكن يمكن تعديلها لطخه جزيئات سطح الخلية أو لتعزيز تلطيخ من الهيكل الخلوي.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips</td>
<td>Tool</td>
<td>Carolina Biological Supply Company</td>
<td>WW-63-3029</td>
<td>12,15,18, 22, 25 mm coverslips available</td>
</tr>
<tr>
<td>Liquinox phosphate-free detergent</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>Z273279</td>
<td>very viscous</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7280</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin, natural mouse</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>23017-015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EMEM (1X)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mediatech</td>
<td>MT-10-010-CV</td>
<td>Distributed by Fisher under the indicated catalog #</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well plate</td>
<td>Tool</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-772-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP151-500</td>
<td>very viscous</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form</td>
</tr>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin, IgG-free</td>
<td>Reagent</td>
<td>Jackson Immunoresearch</td>
<td>001-000-161</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hoechst 33342</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>H-1399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>Reagent</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>viscous</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
			<div>
					</div>

immunocytochemistry: human neural stem cells

كيمياء سيتولوجية مناعية هو وسيلة قوية للغاية واضحة إلى حد ما لتحديد وجود والتطويع اللغوي التحت خلوية ، والوفرة النسبية للمستضد من الفائدة ، والأكثر شيوعا وهو بروتين في الخلايا المستزرعة. يعرض هذا البروتوكول وسيلة سهلة لمتابعة سلسلة من الخطوات التي من شأنها تمكين الباحثين للحفاظ على الأجسام المضادة الابتدائي والثانوي في حين الحصول على الجودة العالية والنوعية والبيانات الكمية استنساخه من تلوين الخاصة بهم. هناك جانبان لهذا البروتوكول الذي يساعد على الحفاظ على حجم الأجسام المضادة اللازمة للتلوين. لأحد ، وتزرع الخلايا على coverslips الصغيرة الدائرية التي يتم وضعها في الآبار من نسيج لوحة الثقافة. بعد التثبيت ، يمكن إزالة الخلايا على coverslips من الآبار لوحة. لتلوين الأجسام المضادة ، هو مقلوب ساترة مع الخلايا على قطرة صغيرة من المحلول على الضد parafilm ومغطاة بقطعة الثاني من parafilm لمنع جفاف. باستخدام هذا الأسلوب ، وهناك حاجة فقط ~ 25 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة لكل ساترة (أو عينة) ليكون الملون. يصف هذا البروتوكول immunostaining من الخلايا الجذعية البشرية / السلائف العصبي (hNSPCs) ، ولكن يمكن استخدامها لكثير من أنواع الخلايا الأخرى.

Watch this Scientific Journal Video about Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells at JoVE.com

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

كيمياء سيتولوجية مناعية قوية هو وسيلة لتحديد وجود والتطويع اللغوي التحت خلوية ، والوفرة النسبية للمستضد من الفائدة في الخلايا المستزرعة. يعرض هذا البروتوكول وسيلة سهلة لمتابعة سلسلة من الخطوات التي من شأنها تمكين أحد الأجسام المضادة للحفاظ على والحصول على أقصى استفادة من تلطيخ واحد.

كيمياء سيتولوجية مناعية : الخلايا الجذعية العصبية البشرية

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of ...

immunocytochemistry-human-neural-stem-cells

Google

Research

JoVE Journal

Biology

27.2K Views.  University of California, Irvine (UCI). كيمياء سيتولوجية مناعية قوية هو وسيلة لتحديد وجود والتطويع اللغوي التحت خلوية ، والوفرة النسبية للمستضد من الفائدة في الخلايا المستزرعة. يعرض هذا البروتوكول وسيلة سهلة لمتابعة سلسلة من الخطوات التي من شأنها تمكين أحد الأجسام المضادة للحفاظ على والحصول على أقص...

Video: Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

انتشار الخلايا الجنينية البشرية (ES) الجذعية

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection reagents has often resulted in poor cell viability and low transfection efficiency.  Other mechanical methods of introducing a gene of interest, such as a &#8220;gene gun&#8221; or microinjection, are also limited by poor cell viability and low numbers of transfected cells.  The strategy of using viral constructs to introduce an exogenous gene into primary cells has been constrained by both the amount of time and labor required to create viral vectors and potential safety concerns.  We describe here a step-by-step protocol for transfecting hNSPCs using Amaxa's Nucleofector device and technology with electrical current parameters and buffer solutions specifically optimized for transfecting neural stem cells.  Using this protocol, we have achieved initial transfection efficiencies of ~35% and ~70% after stable transfection.  The protocol entails combining a high number of hNSPCs with the DNA to be transfected in the appropriate buffer followed by electroporation with the Nucleofector device.

Introducing a gene of interest into a cell is a powerful method for elucidating its function in vivo. This protocol describes an efficient method of transfecting a culture of human neural stem/precursor cells (hNSPCs) using the Nucleofector electroporation apparatus made by Amaxa.

Transfecting الإنسان الخلايا الجذعية العصبية مع Nucleofector Amaxa

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection ...

Counting Human Neural Stem Cells

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as plating cells for immunocytochemistry or for cell transfections. This protocol describes a straightforward and fast method for differentiating between live and dead cells and quantifying the cell concentration and total cell number using a hemacytometer. This procedure first requires detaching cells from a growth surface and resuspending them in media. Next, the cells are diluted in a solution of Trypan blue (ideally to a concentration that will give 20-50 cells per quadrant) and placed in the hemacytometer. Finally, averaging the counts of viable cells in several randomly selected quadrants, dividing the average by the volume of one 1 mm2 quadrant (0.1 &mu;l) and multiplying by the dilution factor gives the number of cells per l. Multiplying this cell concentration by the total volume in &mu;l gives the total cell number. This protocol describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can also be used for many other cell types.

Knowledge of the exact number of viable cells is required for many tissue culture manipulations. This protocol describes how to differentiate between live and dead cells and quantify cells using a hemacytometer. Although it describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), it can be used for other cell types.

عد الخلايا الجذعية العصبية البشرية

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

Passaging Human Neural Stem Cells

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes as well as to explore many fundamental processes of human neural development and pathology.  This protocol presents a simple method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of standardizing this technique and increasing reproducibility of human stem cell research.  The hNSPCs we use were isolated from cadaveric postnatal brain cortices by the National Human Neural Stem Cell Resource and grown as adherent cultures on flasks coated with fibronectin (Palmer et al., 2001; Schwartz et al., 2003).  We culture our hNSPCs in a DMEM:F12 serum-free media supplemented with EGF, FGF, and PDGF and passage them 1:2 approximately every seven days.  Using these conditions, the majority of the cells in the culture maintain a bipolar morphology and express markers of undifferentiated neural stem cells (such as nestin and sox2).

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro allows to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes and to explore human neural development. This protocol presents a method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of increasing reproducibility of human stem cell research.

الركض الخلايا الجذعية العصبية البشرية

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

الماوس البشرة الجذعية العصبية خلية كريست (EPI - NCSC) الثقافات

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

مناعي لونين من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

جيل من الخلايا البشرية باء تنشيط CD40

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

تجميد والذوبان الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

تمايز الخلايا الجذعية الجنينية في السلائف Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...